Capture des protéiplexes formés avec ERNKG

Dans un premier temps, la capture de la protéine ERNKG seule a été étudiée par cytométrie en flux (Figure V-53 A) et par microscopie confocale (Figure V-54). Les cellules mixK5 ont été incubées pendant 30 min en présence de 5 µg d’ERNKG. La capture d’ERNKG a été évaluée par la mesure de la fluorescence rouge des cellules mixK5 à l’aide du cytomètre en flux LSRFortessa (Figure V-53). L’expression du récepteur K5-CD4-GFP a un faible impact sur le pourcentage de cellules capturant ERNKG. En effet, 98,6 ± 0,3 % des cellules exprimant le récepteur ont capturé le récepteur contre 95,1 ± 0,5 % des cellules 293 parentales (Figure V-53 A). Par contre, la quantité de protéine capturée par cellules, représentée par la moyenne de l’intensité de fluorescence (MFI) par cellule est 3,3 fois supérieure lorsque les cellules 293 expriment K5-CD4-GFP (Figure V-53 B). Le prétraitement des cellules mixK5 avec 30 mM de NaClO3 réduit drastiquement la capture non ciblée d’ERNKG par les cellules 293, le

pourcentage résiduel de cellules 293 capturant ERNKG étant égal à 1,3 ± 0,4 % (Figure V-53 A). La réduction de la sulfatation de la surface cellulaire diminue également la capture ciblée, de façon modérée; 84,3 ± 1,2 % de cellules 293/K5-CD4-GFP sont encore capables de capturer ERNKG et la quantité moyenne de protéines capturées est seulement 1,4 fois inférieure comparativement aux cellules non prétraitées.

ERNKG étant une protéine issue de l’ajout par fusion de peptides permettant à E5-RFP de posséder toutes les propriétés nécessaire à la transfection, la capture d’ERNKG par les cellules mixK5 a été comparée à celle d’E5-RFP. Lors de cette expérience, la capture des protéines est déterminée par la quantification de la fluorescence rouge émise par les cellules mixK5. De ce fait, pour pouvoir faire une étude comparative de la capture des deux protéines fluorescentes, le même nombre de protéines fluorescentes doit être incubé avec les cellules. La protéine E5-RFP ou ERNKG a donc été ajoutée à la concentration molaire de 0,12 µM sur 1 mL de cellules mixK5 issues de la même culture cellulaire (Figure V-53). L’ajout des trois peptides en fusion avec E5-RFP entraîne une augmentation de la capture de la protéine par les cellules 293/K5-CD4-GFP, d’un facteur 1,5 et 4,4 concernant le pourcentage de cellules

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capturant la protéine (Figure V-53 A) et la quantité d’ERNKG capturée par les cellules (Figure V-53 B), respectivement. La figure V-53 confirme en premier lieu que les cellules 293 peuvent capturer E5-RFP uniquement lorsqu’elles expriment le récepteur fusionné au K5 (Figure V-53 A), ce qui suggère que les peptides NLS et KH fusionnés à la protéine E5-RFP sont responsables de la capture non ciblée d’ERNKG. Le peptide GALA ne possédant aucune charge positive, il est peu probable qu’il soit impliqué dans la capture non ciblée. Ensuite on constate que la réduction de la sulfatation de la surface cellulaire n’a pas d’effet sur la capture d’E5-RFP par les cellules exprimant K5-CD4-GFP.

Figure V-53. Capture des protéines E5-RFP et ERNKG par les cellules mixK5.

Les cellules mixK5 ont été prétraitées ou non avec 30 mM de NaClO3, puis 0,12 µM de protéine

ERNKG ou E5-RFP a été ajouté sur 1 mL de cellules. Le pourcentage de cellules ayant capturé les protéines fluorescentes (A) et la quantité moyenne de protéines capturées par cellules (B) ont été déterminés par cytométrie en flux, 30 min suivant l’ajout des protéines. Les barres d’erreur représentent les écarts-types des moyennes d’une expérience réalisée en triplicata, n=3. *** valeur-p<0,001 et NS indique une valeur-p non significative.

L’observation des cellules mixK5 par microscopie confocale, 30 min après l’ajout de la protéine ERNKG confirme que ERNKG s’attache et s’internalise dans les cellules 293 indépendamment de la présence du récepteur K5-CD4-GFP (Figure V-54, haut) et que la réduction de la sulfatation de la surface cellulaire entraine l’inhibition de la capture d’ERNKG par les cellules 293 n’exprimant pas le récepteur fusionné au Kcoil, sans abolir l’internalisation d’ERNKG dans les cellules exprimant le récepteur (Figure V-54, bas). Trente minutes après son ajout sur les cellules la protéine ERNKG

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entraine un marquage uniforme de la surface cellulaire plus un marquage cytoplasmique ponctué typique d’une localisation vésiculaire, de manière similaire à celui obtenu avec E5-RFP (Figure V-6).

Figure V-54. Capture ciblée de la protéine ERNKG par les cellules 293/K5-CD4-GFP.

La capture de la protéine ERNKG (rouge) a été observée par microscopie confocale, 30 min après son ajout sur les cellules mixK5 non traitées (haut) ou prétraitées avec du NaClO3

pendant 2 j (bas). Le marquage nucléaire (bleu) a été réalisé avec du Hoechst 33258.

La capture non ciblée de la protéine ERNKG est très probablement due à une interaction électrostatique entre les charges positives de la protéine et les charges négatives des ions sulfates portées par les HSPGs à la surface des cellules. Lors de la transfection, les charges positives d’ERNKG interagissant avec les charges négatives de l’ADNp, il est donc probable que la capture non ciblée des protéiplexes formées avec ERNKG soit inférieure à celle de la protéine seule. Les cellules mixK5 ont donc été incubées avec la protéine ERNKG seule ou sous forme de protéiplexes au ratio massique ADNp:ERNKG égal à 1:5. La capture d’ERNKG a été à nouveau déterminée par cytométrie en flux, 30 min après l’ajout sur les cellules (Figure V-55). La multiplication du pourcentage de cellules ayant capturé ERNKG par l’intensité moyenne de fluorescence rouge émise par cellules, que nous avons nommé intensité totale permet

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une analyse intégrant les deux paramètres. L’ajout d’ERNKG sous forme de protéiplexes formés avec un ADNp non marqué induit une diminution de la capture non ciblée de la protéine de 2,2 fois et une diminution également de la capture ciblée par le système E/Kcoil de 1,3 fois (FigureV-55 A). Ces résultats indiquent que la complexation d’ERNKG avec l’ADNp ne permet pas d’abolir son attachement non ciblé sur les membranes des cellules 293. Lorsque les cellules mixK5 ont été prétraitées avec 30 mM de NaClO3, la complexation d’ERNKG avec l’ADNp n’affecte pas la capture

ciblée. Afin de vérifier que l’ajout d’ADN libre dans le surnageant cellulaire ne modifie pas l’interaction entre les peptides E5 et K5, la même expérience a été réalisée avec la E5-RFP à la place d’ERNKG, à la même concentration molaire (0,12 µM). La figure V-55 B montre que l’addition d’ADNp n’a aucun effet sur la capture d’E5-RFP, que les cellules aient été traitées avec 30 mM de NaClO3 ou non, ce qui indique que l’ajout

d’ADNp libre dans le surnageant cellulaire n’affecte pas l’interaction E/Kcoil.

Figure V-55. Influence de l’ajout d’ADNp sur la capture des protéines ERNKG et E5-RFP par les cellules mixK5.

Les cellules mixK5 ont été prétraitées ou non avec 30 mM de NaClO3, puis 0,12 µM de

protéines ERNKG (A) ou E5-RFP (B) ont été ajoutés sur les cellules en présence ou en l’absence d’ADNp. La quantité totale de protéines capturées a été déterminée par cytométrie en flux, 30 min après l’ajout des protéines. Les barres d’erreur représentent les écarts-types des moyennes, n=3. ** valeur-p < 0,01, *** valeur-p < 0,001 et NS indique une valeur-p non significative.

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Dans le but de vérifier que les protéiplexes formés avec un ADNp non marqué et ERNKG étaient internalisés dans les cellules, les cellules mixK5 ont été transfectées avec des protéiplexes formés au ratio massique ADNp:ERNKG égal à 1:5, puis les cellules ont été imagées par microscopie confocale, 30 minpt (Figure V-56, partie du haut). Comme pour la protéine ERNKG seule, les protéiplexes s’attachent de manière uniforme à la membrane cellulaire et peuvent être internalisés par les cellules indépendamment de l’expression du récepteur K5-CD4-GFP. La figure V-56 (partie du bas) montre que le prétraitement des cellules avec 30 mM de NaClO3 permet d’abolir l’attachement d’ERNKG sur les

cellules 293 parentales et n’empêche pas l’internalisation de la protéine par les cellules 293/K5-CD4-GFP.

Figure V-56. Capture ciblée des protéiplexes formés avec ERNKG par les cellules 293/K5-CD4-GFP.

La capture des protéiplexes formés au ratio massique ADNp:ERNKG égal à 1:5 a été observée par microscopie confocale, 30 min après son ajout sur les cellules mixK5 non traitées (haut) ou prétraitées avec du NaClO3 pendant 2 j (bas). Le marquage nucléaire (bleu) a été réalisé avec

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La fusion des peptides à la protéine E5-RFP pourrait induire un changement de la fluorescence de la protéine et ainsi fausser la quantification de la liaison des protéines transfectrices contenant la RFP sur les cellules 293/K5-CD4-GFP mesurée par fluorescence. Afin de vérifier si la protéine ERNKG possédait une fluorescence rouge similaire à celle d’E5-RFP, des quantités croissantes des deux protéines ont été diluées dans du milieu F17, l’intensité de fluorescence a ensuite été quantifiée par spectrofluorimétrie. La figure V-57 rassemble les intensités de fluorescence obtenues pour les deux protéines en fonction de leurs concentrations molaires. Si la protéine ERNKG possédait des propriétés de fluorescence différentes d’E5-RFP, le rassemblement des données obtenues induirait une faible corrélation entre l’intensité de fluorescence et la concentration molaire. Le coefficient de corrélation obtenu lors de cette expérience est de 0,9462, ce qui indique que les deux protéines excitées à 583 nm possèdent une émission similaire à 612 nm. Ces résultats permettent de confirmer que les fluorescences des protéines E5-RFP et ERNKG peuvent effectivement être comparées pour refléter les quantités de protéines capturées par les cellules.

Figure V-57. Vérification des propriétés de fluorescence rouge (à 612 nm) de la protéine ERNKG comparativement à celles d’E5-RFP.

L’intensité de fluorescence de concentrations croissantes d’ERNKG et E5-RFP a été déterminée par spectrofluorimétrie. R2 représente le coefficient de corrélation de la courbe de tendance linéaire, calculée par le logiciel Excel. Les barres d’erreur représentent les écarts- types des moyennes, n=3.

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