IV. MATÉRIEL ET MÉTHODES
1. Plasmides
Les plasmides utilisés dans cette étude sont tous dérivés du plasmide pTT (Durocher et al., 2002). Ce plasmide contient des séquences nécessaires pour son amplification dans les bactéries : une origine de réplication bactérienne (pMB1, permettant la réplication du plasmide par la machinerie des bactéries), un gène de résistance à l’ampicilline (la β-lactamase, permettant la sélection des bactéries contenant le plasmide à amplifier) sous le contrôle d’un promoteur bactérien (permettant l’expression du gène dans les bactéries). Pour la production de protéines recombinantes dans les cellules de mammifères, ce plasmide contient également un promoteur fort, le CMV5, en amont de la séquence codant le transgène (permettant l’expression dans les cellules de mammifères), une séquence polyA (permettant d’augmenter la stabilité des ARN messagers), et l’origine de réplication épisomale du virus d’Epstein Barr (OriP, pour permettre la réplication du plasmide dans les cellules de mammifères surexprimant l’antigène nucléaire 1 du virus d’Epstein Barr).
Les plasmides déjà utilisés dans la littérature ne seront pas détaillée ici : pTT/GFP (Durocher et al., 2002), pTT/CD4-GFP (initialement nommé pTT/hCD4-GFP) et pTT/BFP (Carpentier et al., 2007), pTT/SP-E5-RFP (Fortier et al., 2013). Compte tenu du nombre de plasmides construits et de la grande variété des stratégies clonales utilisées, l’obtention de chaque plasmide ne sera que brièvement décrite. Toutefois, le tableau II représente les stratégies clonales utilisées, le tableau III représente les amorces utilisées. Les séquences codantes contenues dans les plasmides ne sont pas présentées dans cette thèse, mais toutes les séquences en acides aminés sont représentées dans le tableau A en annexe.
Toutes les enzymes de restriction, polymérases, tampon de réaction, le mélange de dinucléotide (dNTP) proviennent de l’entreprise New England Biolabs, Inc (Pickering, ON).
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Tableau II. Liste des stratégies de clonage utilisées pour les constructions plasmidiques. Plasmide Insert Vecteur Sites d’insertion Séquence Origine pTT/SP-HMGB1 Peptide signal de sécrétion de l’interleukine 2 (SP, P60568§) + ADNc d’HMGB1 (P09429§) GeneART* pTT EcoRI et BamHI pTT/HMGB1 HMGB1 pTT/SP-HMGB1 amplifié par PCR avec les amorces OYD228 et
OYD229
pTT EcoRI et
BamHI
pTT/HMGB1-E5 E5 GeneART* pTT/HMGB1 BstEII et BamHI
pTT/K5-CD4-GFP IL2SP-K5 GeneART* pTT/hCD4-GFP (Carpentier et al., 2007) EcoRI et PciI pTT/K5-CD4-BFP BFP pTT/BFP (Carpentier et al., 2007) pTT/K5-CD4-GFP XbaI et BamHI pTT/HMGB1ab Boites A et B d’HMGB1 pTT/SP-HMGB1 amplifié par PCR avec les amorces OYD228 et
OYD232 pTT BamHI et EcoRI pTT/SP-HMGB1ab SP + boites A et B d’HMGB1 pTT/SP-HMGB1 amplifié par PCR avec les amorces OEL27 et
OYD18
pTT BamHI et
EcoRI
pTT/HMGB1ab-E5 E5
pTT/SP-HMGB1 amplifié par PCR avec les amorces OYD228 et
OYD232 pTT/HMGB1ab BamHI et BstEII pTT/SP-HMGB1ab-E5 Boites A et B d’HMGB1 pTT/HMGB1ab-E5 digéré avec NheI et
BglII
pTT/SP-HMGB1 NheI et BglII
pTT/HMGB1-FL-E5 Peptide espaceur flexible
pTT/HMGB1-E5 Amplification par PCR
avec les amorces OEL47 et OG125
pTT/HMGB1-E5 BglII et
BstEII
pTT/HMGB1-RL-E5 Peptide espaceur
rigide
pTT/HMGB1-E5 Amplification par PCR
avec les amorces OEL48 et OG125
pTT/HMGB1-E5 BglII et
BstEII
pTT/SP-HMGB1ab-FL-E5 Peptide espaceur flexible
pTT/SP-HMGB1ab-E5 Amplification par PCR
avec les amorces OEL47 et OG125
pTT/SP-HMGB1ab-E5 BglII et BstEII
pTT/SP-HMGB1ab-RL-E5 Peptide espaceur rigide
pTT/SP-HMGB1ab-E5 Amplification par PCR
avec les amorces OEL48 et OG125
pTT/SP-HMGB1ab-E5 BglII et BstEII
pTT/ERNKG RNKG GeneWiz** pTT/SP-E5-RFP
(Fortier et al., 2013)
SgrAI§§ et BamHI * GeneART (Regensburg, Allemagne), ** GeneWiz (South Plainfield, NJ), § Numéro des séquences UniProt sur le serveur d’ExPASy, §§ SgrAI est contenu dans la séquence codante de la RFP. Le
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1.1. Digestion enzymatique des plasmides
Lors d’une digestion enzymatique, l’ADN est clivé par des enzymes de restriction au niveau leurs sites de reconnaissance spécifiques. La réaction de digestion a été réalisée pendant 6 à 8 h, à la température et dans le tampon NEBuffer recommandés pour chaque enzyme de restriction par le fournisseur. Les plasmides ont été digérés dans un volume final de 10 µL contenant 1,5 µg de plasmide à digérer, 1 µL de chaque enzyme de restriction et de façon optionnelle, lorsque recommandé par le fournisseur, de l’albumine de sérum bovin (BSA). Pour les enzymes BamHI, EcoRI et XbaI, 1 µL correspond à l’ajout de 20 unités d’enzymes et pour BglII, BstEII, NheI, PciI etSgrAI à 10 unités. Dans le but d’identifier le fragment utilisé comme vecteur ou insert, l’ADNp a été séparé par électrophorèse sur un gel d’agarose 1 %, contenant 12 µg de bromure d’éthidium (BET), dans du tampon Tris-borate-acide éthylène diamine tétra acétique (TBE), pendant 30 min à 200 V, avec comme référence un marqueur de poids moléculaire (1 kb DNA ladder, Invitrogen). La bande correspondant au fragment d’intérêt a ensuite été découpée à l’aide d’un scalpel et a été purifiée grâce à la trousse QIAEXII gel extraction (Qiagen), en suivant les recommandations du fournisseur.
1.2. Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR)
La PCR est une méthode d’amplification d’ADN in vitro permettant d’obtenir un grand nombre de copies. Chaque cycle contient trois étapes : la première consiste en la dénaturation, c'est-à-dire à la séparation des deux brins de l’ADN, la deuxième permet l’hybridation des amorces sur la matrice d’ADN et la troisième consiste en l’élongation grâce à une ADN polymérase. Chaque nouveau fragment amplifié pourra par la suite servir à son tour de matrice. En d’autres termes, cela signifie que si on effectue 40 cycles, pour chaque matrice on peut obtenir en théorie 240 copies (soit 1,1 × 1012
copies).
Les amorces utilisées sont référencées dans le tableau III. Le mélange réactionnel a été effectué sur glace et contient 25 ng de matrice d’ADNp, 20 pM de chaque amorce, une unité de VentR® DNA polymerase, un mélange de dNTP avec une concentration
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(20 mM de Tris-HCl, 10 mM de (NH4)2SO4, 10 mM de KCl, 2 mM de MgSO4, 0,1 % de
Triton® X-100), le volume final était de 50 µ L. La dénaturation initiale est effectuée à 94°C pendant 5 min, suivie de 40 cycles de dénaturation (30 s à 94°C), hybridation (30 s à 55°C), élongation (2 min à 72°C), suivie d’une élongation finale de 7 min à 72°C. L’ADN amplifié a ensuite été purifié grâce à la trousse QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Mississauga, ON), en suivant exactement le protocole du fournisseur.
Tableau III. Liste des amorces utilisées.
Les séquences reconnues par les enzymes de restrictions sont indiquées par des caractères gras, soulignés. * site reconnu non contenu dans l’amorce, mais contenu dans le fragment amplifié. Nom de
l’amorce Séquence de l’amorce
Enzymes de restriction
utilisées
OEL27 AAGGGAGGATCCTCAGCTGCCGCTAAGCTTCTTCTTC BamHI
OEL47 AAAAAAGGTCACCGCTCCAGCACCTGCTCCAGCACCTGCTCC AGCACCTGCTCCAGCACCTGCTCCAGCACCTGCGGTGTCCTCT GGCTCTGGCGGAGGCGAGGTC BstEII OEL48 AAAAAAGGTCACCGTCACCGGAGGAGGAGGGTCCGGAGGAG GAGGATCAGGAGGAGGAGGGTCTGGAGGAGGAGGATCAGCG GTGTCCTCTGGCTCTGGCGGAGGCGAGGTC BstEII OG125 ACTGCTAGAGATTTTCCACACTGACGGATCGATCCTCTAGCTA GAGATCTCC BglII
OYD18 CCCTACACTTGAGTGACAATGAC EcoRI (en
aval*)
OYD228 CTAGAATTCGGCCGGCATGGGCAGCAG EcoRI
OYD229 TCATGATCAGGATCCGGTGACCCCCTCGTCGTCGTCGTCCTC BclI
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1.3. Digestion enzymatique des produits de PCR
Les fragments amplifiés par PCR ont été digérés par digestion enzymatique pendant une nuit, à la température et dans le tampon NEBuffer recommandés pour chaque enzyme de restriction par le fournisseur. Les fragments amplifiés ont été digérés dans un volume final de 50 µL contenant 40 µL de produit de PCR purifié, 1 µL de chaque enzyme de restriction et de la BSA quand recommandé par le fournisseur. Les inserts ainsi digérés ont été purifié à l’aide de la trousse QIAEXII gel extraction, en suivant les recommandations du fournisseur.
1.4. Ligation
Les vecteurs et les inserts ont été ligués, car ils ont été digérés avec des enzymes de restrictions compatibles ayant créé des extrémités cohésives. Les ligations ont été réalisées dans un volume finale de 10 µL, contenant 200 unités de T4 DNA ligase, du tampon T4 DNA ligase (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM de
dithiothréitol, DTT). Lorsque l’insert était un produit de PCR, 4 µL d’insert purifié ont été ligués avec 1 µL de plasmide digéré et purifié. Pour les plasmides issus de la ligation de deux parties d’ADNp, 1,5 µL de vecteur a été ajouté à 7 µL d’insert. La ligation a été effectuée pendant 1 h à température ambiante.
1.5. Amplification des plasmides
Les plasmides ont été amplifiés dans la souche thermocompétente E. coli DH5α, 50 µL de bactéries ont été ajoutées sur 25 ng de plasmide pTT, qui contient le gène de résistance à l'ampicilline, puis elles ont été incubées 30 min sur glace. Le choc thermique a été effectué pendant 1 min à 42˚C, suivi d'une incubation de 2 min sur glace. 5 µL et 10 µL de bactéries transformées ont été étalées sur milieu Circlegrow (40 g/L, MP Biomedicals) avec ampicilline (0,1 mg/mL, Sigma) et agar (15 g/L, Difco) puis incubées à 37°C durant la nuit, afin de permettre la formation de colonies.
Une culture de 100 mL de milieu Circlegrow (MP Biochemicals, Solon, OH) supplémentée avec de l’ampicilline (100 µg/mL, Sigma) a été ensemencée par une
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colonie de bactéries transformées et incubée à 37°C sous agitation à 250 rpm pour la nuit. Les plasmides ont été purifiés en utilisant les kits Maxi-Prep (Qiagen), en suivant les instructions du fournisseur. Toutes les concentrations des ADNp ont été déterminées par mesure de l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific). La pureté de l’ADNp purifié a été déterminée par le ratio 260/280 et se situait entre 1,80 et 1,95 pour tous les plasmides utilisés. Tous les ADNp ont été également analysés par migration sur gel d’agarose, afin de vérifier leur intégrité et la prépondérance de la forme superenroulée. Toutes les séquences codant pour les protéines ou les récepteurs utilisées dans cette étude ont été vérifiées par séquençage (plateforme génomique de l’IRIC, Montréal, QC).