Systèmes de sélection des banques combinatoires

3. Systèmes de sélection des banques combinatoires

Les banques de fragments d’anticorps peuvent être exprimées à la surface de différentes structures comme les phages, les cellules procaryotes et eucaryotes ou encore les ribosomes. Ces systèmes d’exposition permettent de sélectionner une protéine présentée en surface (sur l’activité de liaison à un antigène dans le cas des anticorps) et de fournir un lien physique avec le génotype codant (ADN correspondant). Il est ainsi aisé de remonter aux séquences des clones capables de se lier à l’antigène. A l’aide de ces techniques de présentation, les fragments d’anticorps les plus affins contenus dans ces banques peuvent être rapidement isolés, même s’ils sont présents en très faible nombre.

La construction d’une banque nécessite d’anticiper son protocole de sélection, c’est-à-dire le système utilisé pour présenter à sa surface les fragments d’anticorps constituant la banque. La sélection de la grande majorité des banques d’anticorps recombinants utilise la technique du phage display, technique également employée dans mes travaux de thèse.

Les autres systèmes majeurs de sélection ne seront décrits que sommairement.

Le phage display

Le phage display repose sur l’utilisation de bactériophages filamenteux qui sont des virus de bactéries. La capacité des phages filamenteux à présenter des peptides à leur surface a été décrite pour la première fois par George P. Smith en 1985 (Smith, 1985). Cette technique représente un outil puissant pour l’étude des interactions protéine-ligand in vitro. Ce principe a ensuite été adapté à l’exposition de fragments d’anticorps pour sélectionner des anticorps spécifiques d’une cible (McCafferty et al., 1990).

Une sélection par phage display consiste à réaliser un ou plusieurs tours de sélection pour enrichir étape par étape la proportion de phages exprimant un fragment d’anticorps reconnaissant la cible d’intérêt. Cette sélection fondée sur la capacité de liaison à une cible s’appelle le biopanning (sélection par affinité). Elle repose sur des cycles répétés de liaison, de lavage et d’amplification (Figure 4).

Pour cela, les phages exprimant la banque de fragments d’anticorps sont mis en contact avec l’antigène cible purifié. La méthode la plus utilisée consiste à adsorber l’antigène sur une surface plastique (polystyrène) telle que le fond d’un puits d’une plaque 96 puits, mais toute autre approche permettant la récupération spécifique de l’antigène est utilisable comme la streptavidin pour une protéine biotinylée ou l’utilisation d’un anticorps (anti-His, FLAG, c-myc, etc.) si la protéine

35 recombinante porte un drapeau. D’autres techniques de sélection sur cellules, dans le cas où l’antigène cible est un marqueur de surface cellulaire (Watters et al., 1997), sur des coupes histologiques (Sun et al., 2009) ainsi qu’in vivo (Robert et al., 2006) existent.

Les phages qui présentent un anticorps spécifique pour l’antigène sont retenus par leur interaction avec l’antigène cible tandis que les autres phages, ne liant pas l’antigène, sont éliminés par simple lavage. Les phages liés sont ensuite élués et sont amplifiés par infection d’une souche d’E. coli. Le pool de phages amplifiés obtenu, enrichi de clones spécifiques de la cible, est ensuite à nouveau sélectionné sur la cible. Plusieurs cycles de sélection sont ainsi effectués et permettent d’enrichir en clones d’intérêt et donc de faire émerger des clones faiblement représentés initialement au sein d’une banque. Cette technique mime ainsi in vitro ce qui se passe naturellement lors d’une immunisation : les clones de lymphocytes B aptes à reconnaître l’antigène avec la meilleure affinité sont sélectionnés puis amplifiés par expansion clonale.

Le pool de phages enrichi en clones spécifiques obtenus à la fin du dernier cycle sera ensuite criblé. L’association de la protéine exposée en surface (phénotype) avec son ADN codé par le phage (génotype) permet d'accéder rapidement aux séquences ADN des fragments d’anticorps d’intérêt.

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Autres systèmes de présentation

D’autres méthodes de présentation en surface de microorganismes vivants existent. Elles font intervenir des bactéries ou des cellules eucaryotes telles que des levures ou des cellules de mammifères. Ces techniques de présentation en surface cellulaire ont pour avantage de permettre l’utilisation du FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) pour sélectionner rapidement les cellules exprimant à leur surface des fragments d’anticorps spécifiques d’un antigène donné. Les cellules doublement marquées (pour l’anticorps et l’antigène) sont alors triées et quantifiées en fonction de la liaison à l’antigène (affinité) et de l’expression du fragment d’anticorps à la surface de la cellule (stabilité). Elles sont ensuite remises en culture et réutilisées pour un nouveau tour de sélection contre le même antigène. Le tri cellulaire par FACS permet de discriminer les clones qui ont une affinité différente pour la cible, offrant ainsi la possibilité de sélectionner directement les fragments d’anticorps qui ont la meilleure affinité pour l’antigène.

D’autres approches de sélection in vitro comme le ribosome display et le mRNA display sont indépendantes d’un microorganisme. Elles exploitent les machineries de transcription et de traduction extraites de lysats bactériens ou eucaryotes pour atteindre des tailles de banques plus importantes que celles obtenues par transformation cellulaire.

Les avantages et inconvénients de chaque système de présentation sont résumés dans le tableau récapitulatif qui suit (Tableau 1).

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Tableau 1 : Principaux modes de sélection des banques d’ADNc d’anticorps recombinants

Références

(Griffiths and Duncan, 1998; Souriau et al.,

1998)

(Boder and Wittrup, 1997; Boder et al.,

2012; Chao et al., 2006)

(Ho et al., 2006; Zhou et al., 2010)

(Lipovsek and Plückthun, 2004)

Légende : FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting MACS: Magnetic Assisted Cell Sorting

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