Mise en place du modèle

La production de cytokines proinflammatoires suite à une stimulation au LPS passe par une activation du récepteur TLR4 (Toll-Like Receptor 4). Ce récepteur est exprimé notamment par les cellules immunitaires de la réponse innée et permet, suite à la liaison du LPS bactérien, de déclencher l’activation de cascades de signalisation impliquant entre autres la MAPK p38. Il en résulte une synthèse de cytokines pro-inflammatoires qui agiront alors pour activer les réponses immunitaires, ainsi que des interférons de type I et l’expression des gènes inductibles par les interférons (ISG, Interferon stimulated genes) pour les réponses antivirales et antibactériennes (Lu et al., 2008). L’activité inhibitrice des intracorps sera dans un premier temps testée sur leur capacité à inhiber la production de TNF-α par des cellules THP-1 stimulées au LPS. Nous complèterons par la suite l’analyse par l’étude de différentes cytokines dont l’expression est connue pour être régulée par la p38a (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-17).

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Validation du test phénotypique

Dans notre modèle, la lignée monocytaire THP-1 a été différenciée en macrophages en cultivant les cellules pendant 48h en présence de phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 10 nM) (Lund et al., 2016). Les cellules ont ensuite été stimulées avec du LPS (100 ng/mL) pendant 4h et la quantité de TNF-a sécrétée dans le milieu de culture dosée par ELISA.

Afin de valider notre modèle, nous avons dans un premier temps traitées les cellules avec des concentrations croissantes de l’inhibiteur pharmacologique de p38 SB202190 (Figure 39). Nos résultats montrent que la production de TNF-a induite par la stimulation des cellules THP-1 par du LPS est bien fortement réduite en présence d’inhibiteur de p38.

Figure 39 : Evaluation de l’activité inhibitrice du SB202190 sur la production de TNF-α.

Les cellules THP-1 sont cultivées en présence de PMA pendant 48h. Après 1h de préincubation avec le SB202190, les cellules sont stimulées par du LPS toujours en présence d’inhibiteur pendant 4h. Le TNF-a présent dTNF-ans le surnTNF-ageTNF-ant de culture est dosé pTNF-ar ELISA.

Expression inductible des intracorps

La protéine p38α est une protéine de stress cellulaire impliquée dans la régulation de processus biologiques variés allant de la prolifération cellulaire à l’apoptose. L’expression en continu et à un fort niveau de scFv inhibiteurs dans le cytoplasme pourrait alors s’avérer toxique pour les cellules. Les cellules THP-1 ont donc été transduites par des vecteurs lentiviraux afin d’exprimer un scFv fusionné à la GFP par le système inductible Tet-On® (Clontech) (Giry-Laterrière et al., 2011). L’expression des scFv est alors induite par l’addition de l’antibiotique doxycycline pendant 48h au milieu de culture, durant la phase de différenciation des THP-1 en présence de PMA. La concentration

127 en doxycyline utilisée a été déterminée comme celle permettant un fort taux d’expression par le plus grand nombre de cellules. Le test phénotypique mis en place, avec ses variantes, est détaillé dans la Figure 40.

Figure 40 : Principe du test phénotypique. La lignée THP-1 est cultivée en présence de PMA (10nM)

qui permet la différenciation des cellules en macrophages, et en présence de Doxycyline pour induire l’expression des intracorps scFv-GFP. Après 48h, les cellules sont stimulées avec du LPS (100 ng/mL) pendant 4h. Pour certaines expériences, l’inhibiteur chimique de MAPK p38 SB202190 est préincubé pendant 1 h avant le début de la stimulation au LPS. Les surnageants de culture sont récoltés puis centrifugés et le TNF-α dosé par ELISA.

L’expression des différents scFv au sein des cellules transduites a été évaluée par analyse directe de la fluorescence de la eGFP des cellules par FACS et par microscopie à fluorescence, ainsi que par Western-Blot afin de s’assurer que le signal fluorescent observé est lié à la protéine de fusion scFv-eGFP et non à une protéine tronquée de type scFv-eGFP seule.

L’analyse par FACS (Figure 41.A) nous montre que les protéines de fusion scFv-eGFP sont exprimées avec des niveaux d’expression différents qui reflète la stabilité du scFv dans les cellules (13R4 > B2 > G9). De plus, nous constatons que les scFv ne sont pas exprimés par la totalité des cellules : le scFv G9 est exprimé dans 66,5% des cellules contre 84% et 75% pour les scFv 13R4 et B2 respectivement. Enfin, l’analyse des cellules THP-1 par microscopie à fluorescence permet de confirmer qu’aucun agrégat n’est visible et que les protéines de fusion scFv-eGFP sont retrouvées aussi bien dans le cytoplasme que dans le noyau des cellules (Figure 41.B).

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Figure 41 : Analyse de l’expression intracellulaire des scFv-eGFP dans les cellules THP-1.

L’expression des scFv-eGFP a été induite par l’ajout de Doxycycline au milieu de culture des cellules THP-1 différenciées en présence de PMA. La fluorescence est observée 48h d’expression.

(A) Analyse par FACS du signal de fluorescence eGFP. Le pourcentage de cellules positives ainsi que la

moyenne de l’intensité de fluorescence sont indiqués.

129 Des extraits cellulaires de la lignée THP-1, transduite ou non, ainsi que les précipitations des scFv présents dans ces extraits cellulaires ont été analysés par Western-Blot (Figure 42). Les précipitations ont été réalisées avec des billes magnétiques de Nickel qui permettent, via le tag 6His présent en C-terminal, de capturer les protéines de fusion scFv-eGFP ainsi que les formes tronquées de la protéine comme le montre la présence de plusieurs bandes par piste sur le Blot (pistes 1 à 4). Les bandes présentent dans les pistes des précipitations 2 à 4 ainsi que dans les extraits cellulaires 6 à 8 correspondent à la protéine de fusion scFv-eGFP entière (taille attendue 55,6 kDa), au domaine VL du scFv fusionné à l’eGFP (taille attendue 42 kDa) et à la protéine eGFP seule (taille attendue 29,5 kDa). La quantification des signaux obtenus en Western-Blot montre le pourcentage de chacune des trois formes obtenues pour chacun des intracorps. Les formes tronquées du scFv sont la conséquence de la dégradation des différents linkers de la protéine par des protéases cellulaires, soit du linker reliant les domaines variables de la chaine lourde à la chaine légère (forme VL-eGFP), soit du peptide de liaison avec le fluorophore eGFP. En fonction de l’affinité de l’interaction des domaines VH et VL, il n’est pas exclu que ces derniers restent associés pour former un complexe protéique fonctionnel. Comme ce qui a pu être observé par FACS, le scFv 13R4 possède un meilleur niveau d’expression au sein des cellules et G9 s’exprime avec un niveau moins élevé que les scFv B2 et 13R4. L’absence de signaux dans les pistes correspondantes aux fractions non solubles des extraits cellulaires (pistes 9 à 12) indique que les scFv B2, G9 et 13R4 sont solubles et n’agrègent pas au sein des cellules THP-1 ce qui confirme l’absence d’agrégats visibles en microscopie à fluorescence.

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Figure 42 : Analyse de l’expression des scFv-eGFP dans les cellules THP-1 par Western-Blot. Les

cellules THP-1 ont été cultivées 48h en présence de PMA et de doxycyline (0,5 µg/mL)

Pistes 1 à 4: capture sur billes de Nickel des scFv-eGFP présents dans les extraits cellulaires THP-1. Pistes 5 à 8: extraits cellulaires totaux (environ 135 000 cellules par piste). Pistes 9 à 12: fractions non solubles des extraits cellulaires. La révélation des scFv-eGFP ainsi que des formes tronquées de la protéine a été réalisée grâce à l’anticorps monoclonal 9E10 (hybridome du laboratoire) qui cible le tag c-myc des scFv situé entre la eGFP et le tag 6His.

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Absence d’effet de la doxycyline sur la production de TNF-a

Nous avons d’abord vérifié que le traitement des cellules à la doxycycline nécessaire à l’expression des intracorps ne modifie pas le profil d’expression du TNF-a. Pour cela, nous avons cultivé des cellules THP-1 non transduites ou transduites pour l’expression de l’intracorps 13R4-eGFP avec des concentrations croissantes de doxycyline pendant 48h. Le dosage de la cytokine dans le surnageant de culture montre que la doxycycline, même à la plus forte concentration (1 µg/mL), ne perturbe pas la production et la sécrétion de TNF-a par les cellules THP-1.

Figure 43 : Mesure de l’effet de la doxycyline sur la production de TNF-α.

Les cellules THP-1 ont été cultivées pendant 48h en présence de PMA et de différentes concentrations de doxycycline. Les cellules ont ensuite été stimulées avec du LPS pendant 4h. Le TNF-α présent dans le surnageant de culture a été dosé par ELISA.