L’analyse de la spécificité du scFv G9 par ELISA envers les 4 isoformes de p38 et envers les formes actives et inactives de la p38α nous avait permis de constater que le scFv G9 reconnait la p38α que celle-ci soit phosphorylée ou non et que les productions cytoplasmiques de scFv étaient fonctionnelles (Figure 28). L’étude de l’affinité du scFv pour chacune des conformations de la p38a a été réalisée par SPR.
Figure 28 : Etude par ELISA de la spécificité du scFv G9. Le scFv G9 produit en cytoplasme de bactéries
BL21(DE3) et purifié est testé pour sa spécificité de liaison à l’isoforme p38α. La forme phosphorylée de la p38α (p38αP) est produite chez E. coli après cotransformation de la souche BL21(DE3) avec les constructions codantes pour la p38α et la forme constitutivement active de la MAP2K MKK6-EE. L’activation de la p38α produite et purifiée a été vérifiée par Western-Blot et le niveau de phosphorylation estimé à 100%. La révélation du scFv G9 se fait par l’utilisation de l’Ac monoclonal anti c-myc 9E10 conjugué HRP. Les différents antigènes sont coatés à 10 µg/mL en PBS en plaque 96 puits.
106 La résonance plasmonique de surface est une technique optique qui permet la détection et le suivi d’interactions moléculaires en temps réel et sans aucun marquage. Une des molécules (le ligand) est immobilisée ou capturée sur une biopuce (sensor chip) tandis que l’autre espèce (l’analyte) est injectée dans un flux continu de tampon à la surface de la puce au moyen d’un système de microfluidique. Cette technique permet la détection des variations de masse à la surface de la biopuce dues à la formation et à la dissociation des complexes moléculaires. L’enregistrement du signal SPR en fonction du temps (sensorgramme) pour différentes concentrations d’analyte permet de déterminer les constantes de vitesse d’association (ka) et de dissociation (kd) et d’en déduire les constantes d’association et de dissociation à l’équilibre KA et KD (Figure 29). D’autres paramètres tels que la stœchiométrie d’une interaction peuvent également être étudiés.
Figure 29 : Sensorgramme schématisant les différentes étapes de l’interaction entre un ligand et un analyte. La ligne de base correspond au débit du tampon. Lorsque l’analyte est injecté et qu’il y a interaction, la formation du complexe est suivie par l’augmentation du signal de résonance exprimé en RU (Resonance Unit, 1 RU = changement de densité de surface de 1pg/mm²). A la fin de l’injection, le signal de résonance diminue indiquant la dissociation du complexe. A la fin du cycle, le ligand immobilisé sur la puce peut être régénéré et le signal retourne à la ligne de base (Trabucchi et al., 2013).
107 Pour l’étude de l’interaction entre le scFv G9 et les protéines p38α et p38αP (p38α Phosphorylée), nous avons procédé à une immobilisation indirecte du scFv G9 sur la puce en capturant dans un premier temps l’anticorps monoclonal c-Myc 9E10. Cet anticorps de capture permet d’immobiliser le scFv via son étiquette c-Myc.
Le scFv G9, injecté à une concentration de 50 nM, est dans un premier temps capturé à un niveau de 400 RU sur l’anticorps anti-c-Myc 9E10 immobilisé par couplage covalent sur une puce CM5 à un niveau de 7540 RU. Les p38α et p38αP sont ensuite injectées à différentes concentrations (1,6 à 200 nM) sur le scFv G9 immobilisé. Les sensorgrammes obtenus pour chacune des protéines sont représentés dans la Figure 30.
Figure 30 : Sensorgramme des association/dissociation de p38α ou p38αP au scFv G9. Le scFv G9 (50
nM) est présenté par l’anticorps monoclonal c-myc 910 immobilisé à 7540 RU (ligne de base). Le scFv G9 est capturé à 400 RU pour chacune des cinétiques. Les p38α ou p38αP sont injectées de 1,6 à 200 nM. Chacun des sensorgrammes est corrigé en soustrayant le signal du canal contrôle où aucune protéine n’a été immobilisée (pas d’anticorps c-myc 9E10).
Après soustraction de la pente correspondante à la dissociation longue du scFv G9 on obtient les cinétiques représentées sur la Figure 31 pour la p38α et la p38αP. Les cinétiques pour les deux protéines sont difficilement ajustables à un modèle de type « hétérogène » pour le calcul des constantes de vitesse d’association et de dissociation. Le calcul des constantes d’affinité en « steady state » permet de simplifier la comparaison et de déterminer une constante de dissociation à l’équilibre KD quasi identique : KD = 75 +/- 6,9 nM pour la p38α et KD= 79,8 +/- 2,9 nM pour la p38αP. Le scFv G9 lie donc la p38α et la forme phosphorylée avec des affinités comparables. Néanmoins lorsque l’on compare les profils des cinétiques, les deux protéines ne se comportent pas tout à fait de la même manière : (i) la p38α s’associe plus que la forme phosphorylée au scFv G9 (390 RU pour p38α contre 280 RU pour p38αP à la plus forte concentration) et (ii) cette différence de niveau d’association
108 est due à une vitesse de dissociation plus lente dans le cas de p38α comme le montre la comparaison des profils de dissociation obtenus à 200 nM (Figure 32).
Figure 31 : Détermination des constantes d’affinité du scFv G9 pour la p38α et la p38αP.
(A) Cinétiques d’association/dissociation de p38α et p38αP (1,6 à 200 nM) sur le scFv G9 (50 nM) après
soustraction de la pente de dissociation longue du scFv G9. Le scFv G9 est capturé à 400 RU pour chacune des cinétiques (ligne de base). Chacun des sensorgrammes est corrigé en soustrayant le signal du canal contrôle où aucune protéine n’a été immobilisée (pas d’anticorps c-myc 9E10).
(B) Détermination de la constante de dissociation KD à l’équilibre pour les p38α et p38αP par représentation de type « steady state ».
Figure 32 : Comparaison des cinétiques d’association/dissociation à 200nM de p38α et p38αP normalisées au même niveau de liaison pour visuel des dissociations de chacune des protéines au scFv G9.
109 Les fits hétérogènes peuvent s’expliquer par la présence d’un mélange de formes phosphorylée et non phosphorylée dans chacune des préparations de p38α. Ces protéines ont été produites en bactérie E. coli et purifiées par chromatographie d’affinité sur résine Cobalt. Leur analyse par chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse montre la présence de plusieurs états de phosphorylation pour chacune des deux protéines, l’addition d’un groupement phosphate sur une protéine se caractérisant par un décalage de 80 Da (ou uma, unité de masse atomique) sur le spectre (Figure 33). La préparation p38a est composée majoritairement de forme non phosphorylée mais comprend également une fraction moins importante de formes mono et bi-phosphorylées de la p38α. La production de p38α phosphorylée présente quant à elle 4 pics majoritaires correspondant à différents états de phosphorylation. En effet, en plus de ces résidus Thr180 et Tyr182, la p38α présente de nombreux résidus Thr, Tyr et Ser qui peuvent être phosphorylés et dont certains ont une implication dans la signalisation de p38 (Zou and Blank, 2017). Notons qu’une différence significative dans les masses minimales obtenues pour chaque protéine p38a et p38aP (43 900 uma vs 44 300 uma respectivement) rend complexe l’interprétation des profils massiques, la masse moléculaire attendue, calculée à partir de la séquence de la p38αavec une étiquette 6His étant de 44 042,28 Da. De plus, des modifications post-traductionnelles autres que les phosphorylations peuvent être également présentes dans ces protéines.
Figure 33 : Masse moléculaire des p38α et p38αPrecombinantes produites chez E. coli BL21(DE3).
Dix µg de chacune des préparations de p38 obtenues après chromatographie d’affinité sur résine Cobalt sont analysés par LC-MS. Un delta de masse de 80 uma correspond à la présence d’un groupement phosphate.
(A) Spectre de masse de la p38α. Le pic majoritaire à 43899,9 Da correspond à la p38α non phosphorylée. Les pics à 43978,7 et 44052,9 Da correspondent à des formes mono et bi-phosphorylées de la p38α.
(B) Spectre de masse de la p38αP.Le spectre permet de mettre en évidence au moins 4 sites de phosphorylation.
110