Les inhibiteurs de p38 disponibles aujourd’hui bloquent l’activité kinase de la protéine en ciblant le domaine kinase fortement conservé dans la famille des MAPK. Ils se lient de manière compétitive sur les sites de liaison de l’ATP (inhibiteurs de type I, ex : SB202190), ou bien sur les sites de liaison de l’ATP et les poches hydrophobes adjacentes (inhibiteurs de type II, ex : BIRB796). Très peu d’inhibiteurs de type III, non compétitif de l’ATP, ont été développés jusqu’à présent.
Afin de déterminer le mode de liaison du scFv G9 à la p38α et d’établir le mécanisme moléculaire à l’origine de son activité inhibitrice, deux tests de compétition, l’un basé sur un signal de fluorescence, l’autre sur l’activité enzymatique, ont été réalisés.
1. Test de compétition pour la liaison au site ATP
L’inhibiteur de kinase SKF86002 est un petit imidazole bicyclique qui a pour propriété d’émettre un fort signal de fluorescence une fois lié dans la poche ATP des protéines kinases dont la p38α (Pargellis et al., 2002). Il est utilisé en tant que rapporteur de fluorescence pour le screening d’inhibiteurs de kinase compétitifs de l’ATP (Parker et al., 2014). Nous avons réalisé l’expérience de la façon suivante : la p38a est d’abord "chargée" en SKF86002, puis les scFv ou le SB202190 sont ajoutés à la réaction. La fluorescence est mesurée au cours du temps afin d’observer de façon cinétique un
101 éventuel déplacement du composé SKF86002 de la poche ATP. Une diminution de l’intensité de fluorescence à la longueur d’onde d’émission du SKF (λémisssion 420 nm) indique que le composé testé entre en compétition avec le SKF86002 et est un compétiteur du site de liaison à l’ATP de la kinase. Les cinétiques de fluorescence sont présentées dans la Figure 26.
Figure 26 :Compétition de liaison entre le SKF86002 et les scFv G9 et B2 à la MAPK p38α.
De 0 à 30 sec : intensité de fluorescence de la p38α seule. A 30 sec : injection du composé SKF86002 et apparition du signal de fluorescence. A 90 sec : injection des différents composés testés. La diminution du signal de fluorescence à 420 nm correspond à un déplacement du composé SKF86002 du site de liaison à l’ATP de la p38α. Les concentrations utilisées sont : p38α 200 nM; SKF86002 200 nM; SB202190 2 µM; scFv 1 µM. Le 13R4 sert de témoin négatif. Pour chaque composé testé, 8 mesures ont été effectuées. La longueur d’onde d’excitation : 340 nm ; longueur d’onde d’émission : 420 nm.
102 Contrairement à l’inhibiteur pharmacologique de type I SB202190, la liaison du scFv G9 à la p38a n’entraîne pas de diminution du signal de fluorescence (moins de 1% vs 70% pour le SB202190). Il agit donc comme un ligand non compétitif de l’ATP, se liant sur un site distinct de celui des inhibiteurs ciblant le domaine kinase, ce qui confirme les résultats obtenus en ADP-GloTM.
Le scFv B2 entraine quant à lui une diminution de 44% du signal de fluorescence et est donc un agoniste partiel pour la fixation de l’ATP. La liaison du scFv à la p38a pourrait ainsi modifier la conformation du site ATP entrainant alors une atténuation de la fluorescence du SKF86002 qui est dépendante des interactions du composé avec son microenvironnement et/ou un changement d’affinité pour le composé. Ce résultat peut sembler surprenant compte tenu du fait que le scFv B2 n’entraine pas de modification de l’activité kinase de la p38α. Cependant, il faut tenir compte des conditions expérimentales propres à chaque test : les tests d’activité enzymatique (ADP-GloTM et phosphorylation d’ATF-2) ont été réalisés en présence de très fortes concentrations d’ATP (150 à 200 µM), alors que le test de déplacement du SKF86002, analogue de l’ATP, a été réalisé avec une concentration du composé environ 1000 fois moindre (200 nM). Il semble donc vraisemblable que l’activité agoniste du B2 n’est visible qu’à des faibles concentrations en ATP. La concentration en ATP dans la cellule étant extrêmement élevée (1-10 mM), l’effet du B2 sur la fixation de l’ATP ne devrait pas être présent dans l’environnement intracellulaire de la p38a endogène.
Des résultats similaires ont été obtenus quel que soit l’état de phosphorylation de la p38α utilisée.
2. Test de compétition par mesure de l’activité enzymatique
Pour caractériser davantage le mécanisme d’inhibition du scFv G9, l’activité kinase de la p38α a été mesurée dans des tests de compétition en présence de quantités croissantes du substrat ATP pour différentes concentrations du G9. L’activité catalytique de l’enzyme est mesurée grâce au kit ADP-GloTM (Promega). La représentation du signal de luminescence obtenu après 30 minutes de réaction pour chacune des concentrations de l’inhibiteur en fonction de la concentration en substrat ATP (représentation de Lineweaver-Burke) nous permet de déterminer le Km (constante de Michaelis) en l’absence d’inhibiteur et le Km apparent (Kmapp) pour chacune des concentrations du G9 (Figure 27.A). La constante de Michaelis correspond à la concentration en substrat à laquelle la vitesse de la réaction enzymatique est à la moitié de sa valeur maximale. En présence de concentrations croissantes de G9 on observe une augmentation du Km apparent (intersection des droites avec l’axe des abscisses) et aucun effet sur la vitesse maximale (intersection des droites avec l’axe des ordonnées).
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Figure 27 : Mesure de l’activité enzymatique de la p38α en présence de concentrations croissantes d’inhibiteurs.
(A) Représentation de Lineweaver-Burke de la compétition du scFv G9 avec l’ATP pour l’activité kinase
de la p38α. L’activité enzymatique de la p38α est déterminée en l’absence d’inhibiteur ou en présence de G9 (100, 150, 200, 250, et 300 nM) à différentes concentrations d’ATP. Ces courbes ont permis de déterminer le Km en l’absence de G9 et le Km apparent (Kmapp) pour chaque concentration de G9.
104 Ce profil enzymatique est caractéristique des inhibiteurs compétitifs et indique que le scFv G9 est un inhibiteur compétitif de l’ATP pour l’activité kinase de la p38α. Le calcul de sa constante d’inhibition (Ki = 37 nM) révèle qu’elle est du même ordre de grandeur que celle des inhibiteurs chimiques de p38 (Figure 27.B). Le SB203580 est un inhibiteur de la même classe des pyridinyl imidazole que le SB202190 et possède un Ki de 21 nM (Young et al., 1997). Un autre composé, le PH-797804, inhibiteur de troisième génération qui présente un meilleur profil de sélection pour les MAPK p38 possède un Ki de 5,8 nM pour la p38α (Xing et al., 2009). Le BIRB-796, inhibiteur de type II a un Ki de 0,1 – 22 nM selon les études pour la p38α (http://www.bindingdb.org entrée 1KV2).
L’ensemble de ces résultats indique que le scFv G9, bien qu’il n’empêche pas la fixation de l’ATP, est un inhibiteur compétitif de l’hydrolyse de l’ATP. De plus, il possède une affinité à la p38α du même ordre de grandeur que celles des inhibiteurs chimiques. Le mécanisme moléculaire à l’origine de cette inhibition est certainement dû à un effet allostérique. La liaison du scFv G9 à la p38α entraîne une modification conformationelle de la kinase qui n’empêche pas l’ATP de se lier au domaine kinase mais qui empêche son hydrolyse. Le scFv G9 agit par un mécanisme d’inhibition différent de celui des inhibiteurs chimiques connus actuels et se présente comme un inhibiteur compétitif non conventionnel.
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