La souche non-suppressive HB2151 d’E. coli a été infectée avec les phages élués après le 3ème
tour de sélection contre la p38α. Cette souche reconnait le codon Ambre TAG situé en 5’ du gène pIII comme un codon Stop et permet une expression soluble des scFv dans le périplasme des bactéries et non plus présentés comme une protéine de fusion à la surface du phage. Après environ 16h d’incubation, une certaine proportion des fragments d’anticorps exprimés est retrouvée dans le milieu de culture (Rouet et al., 2012). Les niveaux d’expression dans les phagemides sont suffisamment élevés pour permettre un criblage direct des surnageants de culture.
Après induction de l’expression des scFv par l’ajout d’IPTG, un inducteur gratuit du promoteur au lactose, les surnageants de culture contenant les scFv sont utilisés pour tester la spécificité de liaison et la réactivité des clones sélectionnés par ELISA (Figure 18). Quatre-vingt-quinze clones bactériens sont criblés dans une plaque de microtitration pour leur capacité à lier la p38α et la p38β. Dix-neuf d’entre eux, soit 20% des clones testés, sont clairement positifs pour la p38α et donnent un fort signal
90 avec des valeurs d’absorbances supérieures à 1 (> 5 fois le bruit de fond). Aucun ne présente de réaction croisée envers la p38β confirmant ainsi le profil obtenu avec le stock de phages à l’issue de la sélection (Figure 17B) et l’enrichissement spécifique de la banque en clones liant l’isoforme α.
Figure 18 : Criblage des clones scFv en format soluble obtenus après 3 cycles de sélection contre la p38α. Quatre-vingt-quinze clones de la sélection ont été testés par ELISA pour leur spécificité sur
chacun des antigènes ayant servi à l’épuisement de la banque et à la sélection. La révélation des scFv se fait par l’utilisation de l’Ac monoclonal anti c-myc 9E10 conjugué HRP. Le cut-off choisi pour la sélection des clones positifs est placé à une valeur d’Abs de 1, soit environ 5 fois le bruit de fond (Abs = 0,17).
Les 19 clones ont ensuite été analysés afin de déterminer les séquences des CDR des chaines lourdes (notés H1, H2 et H3) et des chaines légères (notés L1, L2 et L3). Pour rappel, seules certaines positions au sein des CDR (selon la définition de Kabat) ont été considérées pour introduire la diversité de la banque HUSCI. Cela correspond à 3, 2, 3, 2 et 4 résidus dans les boucles L1, L2, L3, H1 et H2 respectivement. En plus des variations de séquence, une variation de la longueur de la boucle H3 a été introduite. La diversité introduite au niveau de ces positions est restreinte à 5 aa qui sont Tyr, Ser, Asn, Asp et Gly selon un pourcentage dégressif. D’autres mutations plus rares au niveau de ces sites peuvent également être observées.
Ainsi, après élimination des séquences « illisibles » en raison d’un mélange de clones, 5 séquences différentes de scFv ont été isolées (Figure 19B). Plusieurs clones présentent une séquence identique, résultat de l’enrichissement d’un même phage initial.
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Figure 19 : Fréquence des clones scFv anti-p38α sélectionnés à l’issue du phage display.
(A) Séquence protéique du scFv 13R4 anti-β-galactosidase ayant servi à la construction de la banque
HUSCI. Les séquences des CDR sont soulignées. Les positions surlignées en gris correspondent aux sites qui peuvent être mutés. Le linker reliant les domaines variables des chaines lourdes et légères est représenté en jaune.
(B) Récapitulatif des mutations isolées des 5 séquences scFv anti-p38α obtenues après séquençage. En
rouge sont représentés les sites d’introduction des mutations sur la séquence du 13R4. Le clone E5 présente en plus des mutations situées dans les CDR une substitution dans le FR1 de sa chaîne légère (P7àL).
Le scFv E5 possède en plus des mutations présentes dans les CDR, une mutation ponctuelle dans le framework 1 de sa chaine légère (Pro7àLeu). Cette substitution a été vraisemblablement introduite lors de la construction de la banque HUSCI. Bien qu’elle soit située en dehors des zones d’introduction définies pour la diversité, nous avons conservé ce clone pour la suite de la caractérisation car il est fonctionnel et spécifique de l’isoforme α comme le montre l’ELISA (Figure 18). Les sélections réalisées en routine au sein de l’équipe mènent généralement à l’identification d’une dizaine à une vingtaine de clones spécifiques de la cible en sortie de phage display. La p38α est une petite protéine de 41 kDa. L’isolation de 5 séquences n’est pas aberrant compte tenu de la taille de la p38 et des étapes de contre-sélection réalisées en amont du phage display, les isoformes α et β partageant près de 75% d’homologie de séquence. Parmi les 5 séquences isolées on peut distinguer 2 familles d’anticorps selon la longueur de la boucle CDR3 du VH : d’un côté les scFv B12 et D9, de l’autre
92 B2, E5 et G9. Afin de savoir si les scFv reconnaissent le même site antigénique ou des sites distincts sur la p38α, nous avons envisagé de réaliser des tests de compétition de liaison à la p38α par ELISA en sandwich. Ne disposant pas de constructions permettant la production de scFv fusionnés à des étiquettes différentes, nous avons reformaté les scFv au format scFv-Fc. Cependant, les anticorps obtenus sont pour la plupart inactifs, incapables de lier la p38α. La présence de plusieurs sites de glycosylations dans leur CDR peut expliquer cette perte d’activité. Les scFv-Fc contrairement au format scFv sont produits en cellules eucaryotes. Les glycosylations au niveau de ces sites impliqués dans l’interaction avec l’antigène peuvent expliquer l’absence de liaison à l’antigène.
Les séquences des scFv B2, B12, D9, E5 et G9 sont ensuite clonées dans différents vecteurs d’expression bactériens pour permettre la production et la purification des fragments d’anticorps nécessaires à la poursuite de leur caractérisation.