Système de conjugaison ATG8/LC

2.2.3.2.1 Les protéines de la famille ATG8

Chez les mammifères, il existe plusieurs homologues à la protéine de levure Atg8, classés en 2 sous-familles : la sous-famille LC3, contenant les protéines LC3A, LC3B et LC3C (He et al, 2003) et la sous-famille « GABAA receptor-associated protein »

(GABARAP), contenant les protéines GABARAP, GABARAP-like 1 (GABARAPL1), GABARAP-like 2 (GABARAPL2) aussi connu sous le nom de « Golgi-associated ATPase

enhancer of 16 kDa » (GATE-16) et GABARAP-like 3 (GABARAPL3) (Xin et al, 2001).

Cependant, à ce jour, seule l’existence du gène GABARAPL3 a été mise en évidence, aucune étude n’ayant encore démontré la présence de la protéine GABARAPL3 chez l’homme (Xin

Le gène GABARAPL1 ou GEC1 (Glandular endothelial cell 1) a été mis en évidence au sein de notre laboratoire comme étant régulé positivement par les estrogènes dans des cellules endothéliales glandulaires d’endomètre de cobaye (Pellerin et al, 1993; Vernier-Magnin et al, 2001). Chez l’homme, la protéine GABARAPL1 présente 96% d’homologie avec la protéine GABARAPL3, 87% avec la protéine GABARAP et 61% avec la protéine GABARAPL2. Cette protéine présente néanmoins un pourcentage plus faible d’homologie avec la sous- famille LC3 : 31% d’homologie avec la protéine LC3A, 29% avec la protéine LC3B et 35% avec la protéine LC3C (Le Grand et al, 2011) (Figure 10).

Figure 10 : Alignement des séquences protéiques des membres de la famille ATG8. Les séquences des protéines

GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2, LC3A, LC3B, LC3C chez l’homme et Atg8 chez la levure sont comparées. En rouge sont symbolisés les acides aminés qui diffèrent de la protéine GABARAPL1. En bleu est représentée la glycine en position C-terminale conservée chez l’ensemble des membres de la famille ATG8. Cette glycine est essentielle pour leur rôle dans l’autophagie. D’après Le Grand et al, 2011.

De plus, les protéines de la famille ATG8 possèdent de fortes similarités au niveau de leur structure tridimensionnelle avec 2 hélices α au niveau de leur extrémité N-terminale, un feuillet β au niveau de leur extrémité C-terminale et une poche centrale proche de celle de l’ubiquitine (Shpilka et al, 2011) (Figure 11).

Figure 11 : Structure cristallographique des membres de la famille ATG8 ainsi que de l’UBIQUITINE. Toutes

les protéines de la famille ATG8 partagent une structure proche de celle de l’ubiquitine, avec 2 hélices α supplémentaires au niveau de l’extrémité N-terminale. (A) GABARAP, Protein Data Bank (PDB) : 1EO6 ; (B) GABARAPL1, PDB : 2R2Q ;

(C) GABARAPL2, PDB : 4C07 ; (D) LC3B, PDB : 1V49 ; (E) UBIQUITIN, PDB : 1UBI. Ces structures ont été obtenues à

partir de la base de données RCSB (www.rcsb.org).

Les membres de la famille ATG8 ont tout d’abord été identifiés comme étant impliqués dans des processus de transport intracellulaire. En effet, GABARAP et GABARAPL1 participent au transport de protéines membranaires de l’appareil de Golgi vers la membrane plasmique, tels que les récepteurs GABAA via leur interaction avec leur sous-unité γ2 (Wang

et al, 1999; Mansuy et al, 2004), le récepteur aux κ opioïdes pour GABARAPL1 (Chen et al,

2006) et le récepteur à la transferrine pour GABARAP (Green et al, 2002). De plus, GABARAP et GABARAPL2 jouent un rôle dans le transport du réticulum endoplasmique (ER) vers le Golgi et au sein du Golgi. En effet, GABARAP peut interagir avec la protéine PX-RCIS (Phox homology-RhoGAP involved in the β-catenin-N-cadherin and NMDA

receptor signaling) et ainsi participer au transport du complexe N-cadhérine/β-caténine de

l’ER vers le Golgi (Nakamura et al, 2008) et GABARAPL2 a été impliquée dans le transport au sein du Golgi de la protéine GOS-28 (Golgi SNARE protein 28) (Sagiv et al, 2000). Les protéines LC3A et LC3B ont été, quant à elles, initialement identifiées dans le cerveau de rat comme étant des protéines co-purifiées avec des protéines associées aux microtubules (Mann & Hammarback, 1994), mais aucune implication directe de cette protéine n’a été reportée dans le transport membranaire.

2.2.3.2.2 Fonctions des membres de la famille ATG8 dans l’autophagie

Le premier lien entre membres de la famille ATG8 et autophagie a été établi chez la levure, où la seule protéine Atg8 a été identifiée comme étant un facteur essentiel de l’autophagie mais également pour le ciblage spécifique de composants cytoplasmiques vers la vacuole (Lang et al, 1998). En ce qui concerne les homologues de la famille ATG8 chez les mammifères, ils peuvent tous être localisés au sein des autophagosomes (Kabeya et al, 2000, 2004; Chakrama et al, 2010). Cependant, pour être localisés au niveau des autophagosomes,

ils doivent subir des modifications post-traductionnelles pour être liés à un phospholipide : le PE (Figure 12). Ainsi, contrairement au système de conjugaison ATG12–ATG5-ATG16L1, les membres de la famille ATG8 ne se lient pas à une protéine, mais à un lipide. On appelle ce type de liaison une lipidation. Tous les membres de la famille ATG8 sont synthétisés sous la forme immature pro-ATG8, dont l’extrémité C-terminale sera clivée par une protéase ATG4 et ainsi exposer un résidu glycine pour donner la forme ATG8-I mature cytosolique. En effet, les protéines de la sous-famille GABARAP possèdent une glycine C-terminale conservée en position 116 (Tanida et al, 2003; Chakrama et al, 2010) et en position 120 pour les membres de la sous-famille LC3 (Kabeya et al, 2004) (Figure 10). La forme ATG8-I est ensuite activée par ATG7 (enzyme E1) puis transférée sur ATG3 (enzyme E2). Pour finir, la conjugaison des protéines de la famille ATG8 au PE sera activée par le complexe ATG12– ATG5-ATG16L1 (enzyme E3), donnant ainsi la forme lipidée et membranaire ATG8-II, liée aux autophagosomes (Tanida et al, 2004). C’est la localisation du complexe ATG12–ATG5- ATG16L1 qui détermine le site de la lipidation d’ATG8 mais facilite également cette réaction en permettant le transfert d’ATG8 de la protéine ATG3 vers le PE (Hanada et al, 2007). L’association des protéines de la famille ATG8 aux autophagosomes concerne à la fois les membranes interne et externe de l’autophagosome. Cependant, cette association est réversible pour les membres de la famille ATG8 qui se trouvent au niveau de la membrane externe. En effet, ATG4B peut délipider ATG8-II en donnant ainsi la forme ATG8-I, pour permettre son recyclage et permettre ainsi la formation de nouveaux autophagosomes (Kirisako et al, 2000) (Figure 12). Les formes ATG8-II présentes au niveau de la membrane interne des autophagosomes seront, quant à elles, dégradées après la fusion avec le lysosome.

Figure 12 : Système de conjugaison des protéines de la famille ATG8. La conjugaison des protéines de la famille

ATG8 au PE est réalisée par une série d’étapes impliquant des protéines ATG. Les protéines ATG8 sont clivées au niveau de leur extrémité C-terminale par ATG4B afin d’exposer leur résidu glycine. Cette forme cytosolique d’ATG8 est appelée ATG8-I. La glycine est ensuite activée par ATG7 (enzyme E1) puis transférée sur ATG3 (enzyme E2). Pour finir, ATG8 est lipidée au PE grâce au complexe ATG12-ATG5-ATG16L1 (enzyme E3) et ainsi donner la forme associée aux autophagosomes ATG8-II. L’association des protéines de la famille ATG8 à la membrane des autophagosomes est réversible et est réalisée par ATG4B.

Parmi toutes les protéines ATG, la famille ATG8 est la seule à être associée aux autophagosomes matures et ses membres servent donc de marqueurs des autophagosomes (Tanida et al, 2004). L’existence de plusieurs membres dans la famille ATG8 implique cependant que ces différents homologues pourraient avoir des rôles différents dans la biogénèse des autophagosomes. En effet, alors que les membres de la sous-famille LC3 auraient un rôle dans l’élongation de la membrane autophagosomale, les membres de la sous- famille GABARAP auraient un rôle plus tardif dans la maturation de l’autophagosome, dans une étape couplée à la dissociation du complexe ATG12–ATG5-ATG16L1 (Weidberg et al, 2010). En effet, il a été montré que GABARAP pouvait recruter la kinase PI4K2A (phosphatidylinositol 4-kinase type 2 α) au niveau des autophagosomes afin de réguler la fusion avec les lysosomes (Albanesi et al, 2015). De plus, une étude récente a suggéré un rôle préférentiel des protéines de la sous-famille GABARAP par rapport à celles de la sous-famille LC3 dans la fusion membranaire (Engedal & Seglen, 2016).

Le recrutement des membres de la famille ATG8 au niveau des autophagosomes peut également être contrôlé par d’autres modifications post-traductionnelles. En effet, il a été montré que LC3 pouvait être phosphorylée par la PKA (protéine kinase A) et que suite à une induction de l’autophagie dans des cellules neuronales, LC3 est déphosphorylée pour activer son association aux membranes (Cherra et al, 2010). De plus, les protéines de la famille ATG8 peuvent être acétylées par l’acétyltransferase p300, ce qui régule de manière négative leur activité (Lee & Finkel, 2009).

En plus de leur rôle dans la biogénèse des autophagosomes, les protéines de la famille ATG8 ont un rôle important dans la reconnaissance et le recrutement spécifique des éléments à dégrader pendant l’autophagie sélective, via des interactions avec des récepteurs autophagiques (Birgisdottir et al, 2013; Wild et al, 2014). En effet, ces récepteurs autophagiques possèdent une région LIR (LC3-interacting region) interagissant avec LC3, qui leur permet de se lier aux protéines de la famille ATG8. De nombreux substrats peuvent être reconnus par ces récepteurs, tels que des substrats ubiquitinylés, des agrégats protéiques ou des mitochondries endommagées et permettent de les diriger vers les autophagosomes grâce à leur domaine LIR. Depuis la découverte de la protéine SQSTM1 (séquestosome 1 ou P62), une protéine aux multiples fonctions qui est également un récepteur autophagique pour les agrégats protéiques ubiquitinylés (Pankiv et al, 2007), de nombreuses autres protéines ont été identifiées comme récepteurs autophagiques. Par exemple, la protéine NBR1 (neighbor of

et al, 2009), la protéine NDP52 (nuclear dot protein of 52 kDa) a, quant à elle, été impliquée

dans l’autophagie des pathogènes intracellulaires (Thurston et al, 2009) alors que NIX est impliquée lors de la dégradation spécifique des mitochondries endommagées, la mitophagie (Schweers et al, 2007). Cependant, il a été montré que la liaison de SQSTM1/P62 aux protéines ubiquitinylées peut conduire à la formation d’agrégats protéiques grâce à la capacité de SQSTM1/P62 de se polymériser. L’agréphagie permet d’éliminer ces agrégats et ce processus d’autophagie spécifique est contrôlé par la protéine ALFY (autophagy-linked FYVE

protein). Cette protéine est recrutée par son interaction avec SQSTM1/P62 afin de faciliter la

séquestration d’oligomères protéiques dans des agrégats plus larges qui pourront être dégradés par l’autophagie. ALFY permet ainsi le recrutement d’ATG5-ATG12 (par sa liaison avec ATG5) au niveau de l’agrégat protéique et grâce à sa liaison au PI3P dans la membrane autophagique, ALFY facilite la liaison d’ATG16L1 pour permettre la lipidation d’ATG8 dans la membrane (Clausen et al, 2010; Filimonenko et al, 2010).