Gènes de l’autophagie et cancer du sein

Puisque les résultats présentés dans la Publication I ont mis en évidence une baisse de l’expression de GABARAPL1 dans les cancers du sein, de manière proportionnelle au grade et régulée par des modifications épigénétiques, nous nous sommes demandé si d’autres gènes de l’autophagie pouvaient être régulés de manière similaire à GABARAPL1. Pour cela, nous avons caractérisé l’expression de six gènes de l’autophagie (ATG9A, ATG9B, BECLIN1,

LC3B, NIX et SQSTM1/P62) dans une nouvelle cohorte de 37 patientes présentant un cancer

du sein (Publication II, Figure 1). D’autres équipes ont déjà montré que l’expression de

BECLIN1 est diminuée dans les cancers du sein (Li et al, 2010; Wu et al, 2012), et plus

particulièrement dans les cancers du sein n’exprimant pas le RE (Tang et al, 2015). Nos résultats sont en accord avec ces publications, car nous observons une baisse, même si elle est

non significative, de l’expression de BECLIN1 chez les patientes de type HER-2 et triple négatif, comparé aux patientes de type luminal A et B.

L’expression de NIX avait déjà été analysée chez des patientes atteintes de cancer du sein mais aucune corrélation n’avait été démontrée entre son expression et le grade des patientes (Sowter et al, 2003). Dans notre cohorte, nous observons que l’expression de NIX semble être plus importante (augmentation non significative) chez les patientes présentant une surexpression d’HER-2 (luminal B et HER-2). Il serait intéressant d’étudier de manière plus approfondie l’implication de NIX chez ce type de patientes. En effet, il a été montré que l’expression de NIX est significativement induite dans des cellules MCF 10A surexprimant HER-2 et résistantes à l’anoïkis (Whelan et al, 2013, 2). L’expression d’HER-2 permet de stabiliser le facteur de transcription HIF-1 dans des conditions normoxiques via la voie mTOR ou PI3K-AKT (Laughner et al, 2001; Li et al, 2005) pour permettre l’expression de nombreux gènes, tels que NIX, mais également l’élimination de ROS et l’inhibition de la mort induite par l’anoïkis, lors du détachement cellulaire (Whelan et al, 2013). Ces données suggèrent un rôle possible de NIX dans les cellules HER-2+ pour induire l’autophagie, afin d’éliminer les ROS, et dans la résistance à l’anoïkis. Ceci pourrait expliquer en partie l’augmentation de l’expression de NIX chez les patientes HER-2+.

Nous avons également observé une légère diminution non significative de l’expression de SQSTM1/P62 dans les cancers du sein triple négatifs mais aucune autre différence dans les autres sous-types de cancer du sein. Ces données sont en accord avec une publication ayant étudié l’expression de SQSTM1/P62 dans différentes lignées de cancer du sein mais n’ayant trouvé aucune différence d’expression de ce gène entre les différentes lignées (Thompson et

al, 2003). Cependant, d’autres études ont montré que le taux de la protéine SQSTM1/P62 est

augmenté de manière significative dans les cancers du sein agressifs ou triple négatifs (Rolland et al, 2007; Luo et al, 2013). Il semblerait donc que l’expression du gène

SQSTM1/P62 ne soit pas corrélée directement à l’augmentation du taux de la protéine dans les

cancers du sein et il serait intéressant de confirmer ces données dans notre cohorte, en analysant le taux de SQSTM1/P62 par TMA (Tissue Microarray) sur les biopsies incluses en paraffine de nos patientes.

L’analyse du taux de LC3B dans notre cohorte nous a permis d’observer une diminution non significative de son expression chez les patientes de type triple négatif. Ces données ne sont pas en accord avec une étude récente ayant montré que l’expression de LC3B est augmentée chez les patientes de type triple négatif (Lefort et al, 2014). Ces données

contradictoires sont peut-être dues à un nombre de patientes de type triple négatif peu élevé dans notre cohorte.

En ce qui concerne ATG9B, une étude récente a montré que son expression est diminuée chez les patientes atteintes de cancer du sein présentant un envahissement ganglionnaire (Zhang et al, 2016). Nous n’avons pas pu confirmer ces résultats dans notre cohorte, probablement à cause d’un nombre de patientes présentant un envahissement ganglionnaire trop faible (n=19). Cependant, nous observons également une diminution de l’expression d’ATG9B, non significative, chez ce type de patientes, comparé aux patientes n’ayant pas d’envahissement ganglionnaire (données non montrées). Notre analyse en fonction du sous- type de cancer du sein semble montrer que l’expression d’ATG9B est diminuée chez les patientes de type HER-2. Il serait intéressant de confirmer ces observations dans une cohorte plus importante car ATG9B pourrait, de manière similaire à NIX, être régulé par l’expression d’HER-2.

L’étude de l’expression d’ATG9A dans notre cohorte de 47 patientes a montré la plus importante augmentation d’expression génique, comparée aux autres gènes de l’autophagie testés. Dans le but de confirmer ces résultats, nous avons augmenté la taille de notre cohorte et avons ainsi montré une augmentation significative de l’expression d’ATG9A chez les patientes triple négatives. L’étude de Zhang et al., citée précédemment, a cependant montré une baisse significative de l’expression d’ATG9A, associée à une hyperméthylation de son promoteur, dans des échantillons de cancer du sein comparé au tissu sain adjacent à la tumeur (Zhang et al, 2016), mais nous sommes dans l’incapacité de comparer leurs résultats aux nôtres car les auteurs n’ont pas montré l’expression d’ATG9A en fonction des différents sous- types de cancer du sein. Cependant, lorsqu’ils étudient l’expression d’ATG9A en fonction de l’expression du RE, RP ou HER-2, les auteurs montrent une baisse significative de l’expression d’ATG9A uniquement chez les patientes HER-2+. Nos données sont donc en accord avec leurs résultats car nous observons également une baisse de l’expression d’ATG9A, uniquement chez les patientes présentant une amplification de l’expression d’HER-

2 (luminal B et HER-2). En effet, nous observons une diminution de la moyenne d’expression

d’ATG9A chez les patientes de type luminal B et HER-2, comparé aux patientes luminal A et triple négatives. Il serait donc intéressant d'étudier la régulation de l'expression d'ATG9A par des modifications épigénétiques dans notre cohorte de patientes. Dans ce but, nous avons réalisé une extraction des ADN génomiques provenant d'échantillons de nos patientes de type triple négatif et souhaitons réaliser prochainement une expérience de Methylcollector, afin

d'analyser les modifications post-traductionnelles des histones au niveau du promoteur d'ATG9A, en réalisant des expériences d'immunoprécipitation de chromatine à partir d'échantillons de nos patientes fixés au formol et inclus en paraffine (Fanelli et al, 2011).

Nos données ainsi que celles de Zhang et al, suggèrent un rôle d’ATG9A chez les patientes exprimant HER-2, ce qui a été démontré dans une étude récente montrant que l’expression de la protéine ATG9A est diminuée dans les cellules BT-474 résistantes au trastuzumab (Nunes et al, 2016). De plus, un taux élevé de l’expression d’ATG9A chez les patientes HER-2+ est associé à une durée de vie sans rechute plus longue (Györffy et al, 2010). Il semblerait donc que l’expression réduite d’ATG9A dans les cellules présentant une amplification d’HER-2 soit également impliquée dans l’agressivité de ces dernières.

Cependant, le rôle d’ATG9A dans les cancers du sein triple négatifs semble être différent de celui dans les cancers du sein HER-2 puisque dans notre étude, nous avons montré une augmentation significative de l’expression d’ATG9A dans les cancers du sein triple négatifs. De plus, nous avons analysé des données de survie de patientes atteintes de cancer du sein, mises à disposition en ligne avec l’outil « KM-plotter », outils permettant d’étudier l’effet de l’expression de plusieurs milliers de gènes sur la survie des patientes (Györffy et al, 2010). Cette étude bioinformatique a montré qu’un taux élevé de l’expression d’ATG9A chez les patientes triple négatives est associé à une durée de vie sans rechute plus courte (Györffy et al, 2010). Il serait intéressant de confirmer ces données dans notre cohorte, mais à ce jour, les données actuelles de suivi ne permettent pas de conclure. En effet, les biopsies utilisées dans notre étude ont été incluses de janvier 2007 à septembre 2014, et pour l’instant, 7 patientes présentent une rechute de la maladie, dont 5 patientes ont une expression d’ATG9A élevée, comparé au tissu sain adjacent à la tumeur. Parmi ces 5 patientes, 3 patientes sont de type triple négatif et les 2 autres appartiennent au sous-type luminal B. Il semblerait donc que l’expression élevée d’ATG9A chez les patientes de type triple négatif au sein de notre cohorte soit un facteur de mauvais pronostic, comme ce qui a été décrit avec l’analyse bioinformatique citée précédemment (Györffy et al, 2010).

L’expression de l’ARNm des gènes n’étant pas toujours corrélée au taux de la protéine dans la cellule, nous avons souhaité étudier le taux de la protéine ATG9A dans les tissus provenant des patientes de notre cohorte. Nous avons alors réalisé un TMA sur le tissu sain ou cancéreux provenant de 11 patientes et réalisé un marquage immunohistochimique pour ATG9A. Malheureusement, le TMA est encore en cours d’analyse mais nous espérons obtenir très prochainement les résultats. Nous souhaitons également utiliser le TMA réalisé afin

d'étudier l'expression des protéines ATG9B, BECLIN1, LC3B, NIX et P62/SQSTM1 chez nos patientes et comparer nos données obtenues par qRT-PCR chez ces mêmes patientes.