Synthèse de la 5-hydroxyméthyl-2’-désoxycytidine

Nous avons donc dans un premier temps réalisé la synthèse de la 5hmdC. Celle-ci a déjà été décrite et peut être envisagée à partir de différents nucléosides précurseurs, présentés dans la figure 76.

Figure 76. Voies rétrosynthétiques possibles pour obtenir la 5hmdC.

Dans tous les cas, le nucléoside de départ est sous la forme céto en position 4 du cycle pyrimidique et la synthèse nécessite une étape de conversion en fonction amine. Différents groupements protecteurs orthogonaux peuvent être employés pour la protection des fonctions hydroxyles selon que la molécule est destinée par la suite à être incorporée dans un oligonucléotide ou non. L’étape clé est donc l’introduction de la fonctionnalisation en position 5 de la base. Les nucléosides de départ peuvent donc être :

- Voie A : La thymidine, un nucléoside naturel qui peut être halogéné sur son méthyle en position 5 en présence d’Azobisisobutyronitrile (AIBN) et de N-Bromosuccinimide (NBS). L’halogène est ensuite substitué par le 3-hydroxypropionitrile, qui après déprotection conduit à l’alcool correspondant184. - Voie B : La 5-iodo ou 5-bromo-2’-désoxyuridine est commerciale et peut subir une

formylation par l’action du monoxyde de carbone catalysée par du palladium. Le groupement formyle est ensuite réduit en alcool par NaBH4/CeCl3¹⁷⁹.

- Voie C : La 2’-désoxyuridine est également commerciale. L’hydroxyméthyle peut être introduit directement en présence de formaldéhyde¹⁸⁵. Nous avons choisi cette dernière voie qui nécessite moins d’étapes et des réactifs peu coûteux.

La 5hmdC a été donc été synthétisée en 4 étapes, selon une procédure de la littérature (Figure 77)185. La première étape consiste en l’hydroxyméthylation de la 2’-désoxyuridine (dU) en présence de formaldéhyde et de triéthylamine dans de l’eau, pour former le composé

11 avec un rendement de 60%. Les groupements alcools de celui-ci sont ensuite protégés par

le TBDMSCl en présence d’imidazole dans le DMF pour donner le composé 12 avec un

rendement non optimisé de 36%. La conversion du groupement carbonyle en position 4 du cycle pyrimidique est ensuite effectuée par un traitement au TPSCl dans l’acétonitrile en présence de DMAP et de triéthylamine, suivi d’un traitement à l’ammoniaque pour achever la formation du composé 13 avec un rendement de 65%. La déprotection finale des groupements TBDMS par le TBAF dans le dichlorométhane permet d’obtenir la 5hmdC avec un rendement 70%.

2.2.1.2 Mise au point des conditions d’oxydation de l’alcool

allylique de la 5hmdC

Une fois la synthèse de la 5hmdC réalisée, nous avons effectué différents essais d’oxydation de l’alcool allylique afin d’accéder à la 5-formyl-2’-désoxycytosine (5fdC) (Figure 78), le but étant de définir des conditions de réactions simples compatibles avec un traitement d’échantillons d’ADN génomique. Pour cela, nous avons choisi des oxydants spécifiques des alcool allyliques et fait varier le solvant, la température et le temps de réaction, en nous appuyant sur des conditions décrites dans la littérature^61,186,187. Les différentes conditions utilisées ainsi que les rendements d’oxydation obtenus sont résumés dans le tableau 3.

Figure 78. Oxydation sélective de la 5hmdC en 5fdC

Essai ^{Oxydant Température Solvant} Temps Rendement Nature _{d’équivalents} ^Nombre

1 _{RuO2 5} 80°C Eau/dioxane 9h 25 %

2 _{RuO2 5} RT Eau/dioxane 12h 76 %

3 _{RuO2 5} 60°C Eau/dioxane 4h 90 %

4 _{RuO2 5} 60°C Eau 12h 80 %

5 _{Mn(OAc)3 6} RT Eau/dioxane 24h 10 %

6 _{KRuO4 3} 0°C ^{Eau, NaOH}

7 _{KRuO4 3} 60°C ^{Eau, NaOH}

(0,05 M) ^{4h 67 %}

8 _{MnO2 6} RT Eau/dioxane 12h 25 %

9 _{MnO2 6} 60°C Eau/dioxane 4h 63 %

Tableau 3. Optimisation des conditions d’oxydation de la 5hmdC

Les réactions ont été suivies par CCM, puis, chaque brut réactionnel a été analysé par HPLC sur une colonne C18 en phase inverse (Figure 79). Les produits majoritaires ont été récoltés et analysés par spectrométrie de masse à la plateforme de Protéomique et de Spectrométrie de Masse de l’UPMC avec l’aide de Thierry Blasco.

L’analyse par HPLC et par spectrométrie de masse a permis d’établir que la quasi-totalité de la 5hmdC est convertie en 5fdC par l’action du dioxyde de ruthénium en 4 heures, dans un mélange eau/dioxane chauffé à 60°C (conditions 3). Avec l’oxyde de magnésium, le perruthénate de potassium ou l’acétate de manganèse, le produit de départ 5hmdC reste présent en grande quantité et il y a formation de produits secondaires que nous n’avons pas réussi à identifier en masse. Le rendement est quelque peu modifié par l’augmentation du temps de réaction, les différences ne sont pas significatives. Alors que le perruthénate de potassium a été très utilisé dans un certain nombre d’études pour oxyder la 5hmC, comme nous l’avons présenté dans la partie introductive de ce chapitre, nous avons pu observer que ce n’était pas l’oxydant le plus efficace dans les conditions que nous avons testées. La température idéale se situe pour l’ensemble des oxydants autour de 60 °C.

Figure 79. Chromatogrammes HPLC de A. la 5hmdC ; des bruts réactionnels de l’oxydation

de la 5hmdC par B. RuO2 (conditions 3), C. Mn(OAc)3 (conditions 5),

D. KRuO4 (conditions 7), E. MnO2 (conditions 9).

Afin de s’assurer que l’oxydation de la 5hmC ne dégradait pas les autres bases de l’ADN, la 2’-désoxyadénosine (dA), la 2’-désoxyguanosine (dG), la 2’-désoxycytidine (dC) et la 2’-désoxythymidine (dT) ont été soumises aux conditions d’oxydation 3. L’analyse comparative par HPLC analytique des échantillons oxydés et non oxydés a permis de déterminer que l’oxydation par le dioxyde de ruthénium dans la condition 3 n’affectait que l’alcool allylique de la 5hmC et ne dégradait pas les autres nucléosides constitutifs de l’ADN.

2.2.1.3 Mise au point des conditions de fonctionnalisation de la

5hmdC par la biotine-hydrazine

L’étape de fonctionnalisation de la 5fdC obtenue précédemment a alors été réalisée en présence d’une biotine comportant une fonction hydrazine, en nous basant sur des conditions décrites dans la littérature, dans une solution aqueuse d’acide acétique à 10% à 37°C (Figure 80) ¹⁸³.

A B C

Figure 80. Fonctionnalisation de la 5fdC par la biotine hydrazine.

Le brut réactionnel a été analysé et purifié par HPLC sur colonne C18 en phase inverse (Figure 81). Les pics des produits ont été récoltés et analysés par spectrométrie de masse LC-MS/MS à la plateforme de l’UPMC comme précédemment. Au bout de 12 heures à 37°C, on observe la disparition totale de la 5fdC et la formation de trois produits dont deux majoritaires. La fraction 3 (majoritaire) correspond à la 5biotC (Figure 80 C). Les deux autres n’ont pas pu être identifiés.

Figure 81. Fonctionnalisation de la 5fdC A) Profils HPLC de la 5fdC avant réaction ; B)

Profils HPLC du brut réactionnel après 12 heures de réaction avec la biotine-hydrazine ; C) Spectre MS/MS de la fraction F3.

A l’issue de cette étude, nous avons mis au point sur des nucléosides modèles des conditions optimales d’oxydation de l’alcool allylique de la 5hmC pour obtenir la 5fC. La fonctionnalisation de celle-ci s’effectue ensuite simplement en présence d’hydrazine-biotine en milieu faiblement acide. Nous avons ensuite cherché à appliquer ces conditions à l’oxydation et à la fonctionnalisation d’oligonucléotides contenant la 5hmC.