Stratégie pré-synthétique : introduction du groupement photoactivable via les

Compte tenu des spécificités de la synthèse chimique de l’ADN, deux voies sont possibles pour l’introduction de fonctions photoactivables dans des séquences d’ADN. On peut soit utiliser des synthons phosphoramidites portant déjà des fonctions photoactivables (stratégie de fonctionnalisation pré-synthétique), ou bien greffer les fonctions photoactivables en fin de synthèse automatique sur l’oligonucléotide (stratégie de fonctionnalisation post-synthétique) (Figure 99).

Figure 99. Les deux stratégies principales de fonctionnalisation d’oligonucléotides : A)

Marquage pré-synthétique ; B) Marquage post-synthétique. (Les nucléotides sont représentés en bleu ; les fonctions réactives sont représentées sous forme de bâtonnets rouges et les modifications introduites sont représentées sous forme de ronds rouges). D’après 235.

Le principe de ces deux approches sera illustré en s’appuyant sur des exemples de la littérature.

1.4.3 Stratégie pré-synthétique : introduction du groupement

photoactivable via les synthons phosphoramidites

La modification pré-synthétique des oligonucléotides consiste à introduire la modification souhaitée (ici, l’agent de photomarquage) sur le synthon phosphoramidite. Ce

dernier est ensuite utilisé dans la synthèse sur support solide et incorporé à la position souhaitée. Le pré-requis pour l’utilisation de cette stratégie est que le phosphoramidite devra être suffisamment stable pour résister aux conditions de synthèse et de déprotection (milieu acide, basique, conditions oxydantes) des oligonucléotides. Dans le paragraphe qui suit, nous allons présenter quelques exemples de cette stratégie appliqués à la préparation de sondes d’acides nucléiques photoactivables.

1.4.3.1 Introduction directe de nucléobases photoactivables

En ce qui concerne l’incorporation des bases photoactivables mentionnées dans le paragraphe 1.3, il est possible d’accéder aisément aux synthons phosphoramidites correspondants, leur synthèse étant bien maitrisée236,237. Ces synthons sont d’ailleurs accessibles commercialement, ce qui rend la méthode phosphoramidite incontournable si l’on souhaite incorporer ces bases photoactivables par la voie chimique. La Figure 100 présente plus particulièrement deux phosphoramidites disponibles chez Glen Research. Il est à noter que le groupement protecteur cyanoéthyl du phosphoramidite pour l’incorporation de la ^4ST nécessite une étape de déprotection supplémentaire au DBU.

Figure 100. Phosphoramidites disponibles commercialement (Glen Research) ; a)

phosphoramidite pour l’incorporation de la 4ST ; b) phosphoramidite pour l’incorporation de la ^5IdU.

1.4.3.2 Incorporation d’agent de photomarquage via des bras

espaceurs sur le nucléoside

Dès qu’on souhaite introduire d’autres groupements photoactivables via des bras espaceurs sur la partie sucre ou base du nucléoside, la synthèse de phosphoramidites plus

complexes doit être envisagée avec une fonctionnalisation sur la partie sucre ou la partie base nucléique qui nécessite la mise en œuvre d’un jeu de protection/déprotection important.

La figure 101 présente un exemple de synthèse d’un phosphoramidite permettant l’introduction d’une fonction trifluoromethylphenyldiazirine dans un analogue de la thymidine sur la position 5 de la base, réalisée par le groupe de Thomas Carell238. La synthèse commence par la protection des alcools de la 5IdU par des groupements TBDMS, suivie d’un couplage de Sonogashira qui permet l’introduction d’un espaceur triéthylène glycol auquel on vient coupler ensuite la trifluorométhylphényldiazirine pour donner le composé 46. Les étapes finales sont la déprotection des alcools, la protection de l’alcool primaire en 5’ par un groupement DMT et la phosphitylation finale. Une fois synthétisé et purifié, le phosphoramidite 48 peut être utilisé lors d’un cycle de synthèse automatique pour être introduit dans une séquence oligonucléotidique. Après complétion de la synthèse, clivage du support et purification par HPLC, la sonde oligonucléotidique peut être utilisée. Dans cet exemple, cette sonde photoactivable a été complexée à un brin complémentaire comportant une 8-Oxo-2'-désoxyguanosine, un dommage oxydatif de l’ADN, ce qui a permis d’identifier de nouvelles protéines interagissant avec ce dommage oxydatif de l’ADN.

Figure 101. Synthèse du synthon phosphoramidite d’un analogue de thymidine comportant

un groupement photoactivable en position 5 du cycle pyrimidique238.

Pour illustrer l’introduction d’un groupement photoactivable sur la partie sucre d’un nucléoside, on peut citer les travaux de Lebman et al. (Figure 102)239. Le réactif 49 est obtenu en quelques étapes de synthèse à partir de la 5’-formylthymidine240. L’alcool introduit en position 4’ est sélectivement fonctionnalisé par une trifluorométhylphényl diazirine à partir du dérivé iodé 50 correspondant. Les alcools en position 5’ et 3’ du composé 51 sont ensuite déprotégés avec du TBAF. L’alcool primaire en position 5’ de 52 est ensuite protégé avec un groupement DMT, puis le synthon est greffé sur un support solide avec des agents de couplage. Les auteurs ont ensuite utilisé cette résine 54 dans des cycles de synthèse automatique pour obtenir des sondes oligonucléotidiques comportant un analogue de thymidine photoactivable à leur extrémité 3’. L’intérêt de l’introduction à la position 4’ du

sucre est qu’elle permet de projeter le groupement photoactivable dans le petit sillon de l’ADN à proximité des liaisons phosphodiesters, qui est une région ciblée par de nombreuses enzymes de réplication de l’ADN. Les auteurs ont ensuite utilisé leur sonde pour photomarquer l’ADN polymérase humaine.

Figure 102. Synthèse et greffage sur colonne d’un analogue de thymidine comportant un

groupement photoactivable en position 4’ du sucre (LCAA-CPG : Long Chain Aminoalkyl-Controled Pore Glass).

L’introduction de groupements photoactivables via la stratégie pré-synthétique présente certains aspects contraignants. Il faut trouver des groupements protecteurs adaptés à la fonction photoactivable que l’on souhaite introduire, ou bien que cette fonction photoactivable soit stable lors des étapes de la synthèse du phosphoramidite ainsi que pendant la synthèse automatique qui a lieu dans des conditions assez drastiques. De plus, si l’on

souhaite varier la nature de la sonde photoactivable ou de l’éventuel bras espaceur, il faut resynthétiser le phosphoramidite correspondant, ce qui présente à chaque fois un effort de synthèse non négligeable. Par ailleurs, un problème majeur qui peut survenir lorsque des phosphoramidites hautement modifiés sont utilisés dans un cycle de synthèse automatique sur support solide, est la chute de rendement de synthèse lors du couplage de ce synthon qui peut diminuer drastiquement le rendement en oligonucléotide final.

1.4.4 Introduction du groupement photoactivable par la