Recherche de protéines interagissant spécifiquement avec 5hmC et ses dérivés

Pour tenter d’identifier de nouvelles protéines interagissant avec les cytosines modifiées présentes dans l’ADN, l’une des méthodes employées a été d’effectuer des expériences dites de « pull-down ». Elles consistent à incuber des séquences d’ADN comportant les différentes cytosines dans des extraits cellulaires de différentes natures. Après

l’incubation, des étapes de purification et de concentration permettent de récupérer uniquement les protéines interagissant de manière spécifique avec les séquences d’ADN utilisées. Les protéines récupérées par cette méthode sont ensuite analysées et identifiées par gel d’électrophorèse, par immunofluorescence ou par spectrométrie de masse. La comparaison entre les différentes protéines récupérées selon la nature de la séquence d’ADN utilisée permet d’identifier les différents profils d’interaction des protéines. Souvent, ces résultats sur des extraits cellulaires sont confirmés par l’expression et la purification des protéines recombinantes d’intérêt suivies d’études in vitro.

Une expérience de pull-down avec des séquences comportant des 5mC, des 5hmC ou des cytosines non modifiées a ainsi permis d’identifier par électrophorèse ZBTB2, un facteur de transcription impliqué dans la régulation du cycle cellulaire, comme protéine reconnaissant des oligonucléotides contenant la base C ou la 5mC mais pas la 5hmC, dans des extraits de trois lignées cancéreuses99. Ces résultats ont été confirmés par la purification de la protéine recombinante et l’étude de son interaction in vitro.

Deux études se sont consacrées à la tâche d’identifier, par spectrométrie de masse, les différents profils de protéines interagissant avec les dérivés oxydés de la cytosine. Les groupes de Balasubramanian et de Reik ont incubé des séquences de promoteurs comprenant des cytosines, des 5mC, des 5hmC et des 5fC en présence d’extraits de cellules souches embryonnaires de souris. L’analyse par spectrométrie de masse des différents échantillons de protéines enrichies a d’abord permis de confirmer l’affinité d’Uhfr1 pour les séquences contenant des 5mC ou des 5hmC, ainsi que celle de Td pour les promoteurs contenant des 5fC. Au contraire de l’étude de Yildirim et al,⁹⁸ présentée précédemment, la protéine MBD3 ne présentait pas de liaison spécifique à 5hmC comparée à 5mC, mais plutôt une affinité pour 5mC ou pour 5mC/5fC selon la séquence de promoteur utilisée. La majorité des protéines identifiées se liant préférentiellement à 5fC avaient une fonction dans la régulation de la transcription et de la chromatine, comme par exemple le complexe Nurd. Le knockdown des protéines identifiées comme interagissant préférentiellement avec la 5fC n’a abouti à l’augmentation des niveaux de 5fC et de 5caC que dans l’unique cas de la TDG. Cela permet d’écarter le rôle de ces protéines dans la réparation de l’ADN et l’excision de 5fC/5caC et plutôt de leur attribuer un rôle de reconnaissance de 5fC comme modification épigénétique.

La deuxième étude a été réalisée par les groupes de Thomas Carell et de Michiel Vermeulen, en utilisant des techniques de protéomique quantitative qui permettent de

comparer directement par spectrométrie de masse les quantités de protéines présentes dans les échantillons¹⁰⁰. Ils ont utilisé des séquences comportant des cytosines, 5mC, 5hmC, 5fC et 5caC et les ont incubés dans trois types différents d’extraits cellulaires : les cellules souches embryonnaires de souris, les cellules souches neurales de souris et les cerveaux adultes de souris. Dans des extraits de cellules souches embryonnaires de souris, MeCP2 et Uhrf1 ont été confirmés comme lecteurs des 5mC et des 5hmC, ainsi que Thy28, une protéine non caractérisée liée à l’apoptose. La protéine MBD3 n’est pas un lecteur des 5hmC mais au contraire des cytosines non modifiées. Cette interaction préférentielle pour la cytosine par rapport à la 5hmC a été confirmée avec la protéine recombinante purifiée. Toujours dans les cellules souches embryonnaires de souris, les séquences contenant des 5fC et des 5caC recrutent principalement des protéines impliquées dans la réparation des dégâts oxydatifs, avec peu de recouvrement entre 5fC et 5caC, ce qui suggère des rôles différents pour ces deux modifications de la cytosine. La glycosylase TDG se lie préférentiellement avec la 5fC et la 5caC et pas avec la 5hmC, confirmant une nouvelle fois son rôle dans la déméthylation de l’ADN. La 5fC, au contraire de la 5caC, enrichit spécialement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN, comme p53, un facteur de transcription régulant la mitose et l’apoptose des cellules et dont les mutations sont impliquées dans un grand nombre de cancers. Les lecteurs de la 5caC comprennent des protéines appartenant à des complexes remodeleurs de la chromatine mais aussi DNMT1. Globalement, cette étude montre que la cytosine et la 5mC recrutent beaucoup plus de protéines que la 5hmC, et beaucoup moins que la 5fC et la 5caC. Cette observation, confirmée dans l’étude présentée précédemment, semble orienter la 5fC et la 5caC vers un rôle de modification épigénétique, au contraire de la 5hmC qui serait un intermédiaire dans la déméthylation des cytosines.

Dans les cellules souches neurales de souris, un effet délétère de l’oxydation des 5mC sur la liaison avec les facteurs de transcription a été observé. La majorité des protéines interagissant avec la 5hmC est impliquée dans des processus de réparation de l’ADN. La protéine Uhrf2 est un lecteur spécifique des 5hmC, et son interaction avec la 5hmC et dans une moindre mesure avec la 5fC et 5caC a été vérifiée avec la protéine recombinante. De plus, la co-expression de la protéine avec le domaine catalytique de TET1 dans des cellules HEK293T, des cellules rénales embryonnaires humaines, aboutit à l’augmentation des niveaux de 5hmC, 5fC et 5caC. Cette observation permet de proposer pour Uhrf2 un rôle de facilitateur de l’oxydation successive des 5mC par les protéines TET, peut-être en faisant

basculer la 5hmC en dehors de la double hélice d’ADN et en la rendant plus accessible aux protéines TET.

Enfin, dans les extraits protéiques de cerveaux adultes de souris, et au contraire des cellules souches neurales ou embryonnaires, une plus grande quantité de protéines interagissant avec la 5hmC qu’avec la 5mC a été observée. Un des lecteurs spécifiques de la 5hmC caractérisé est Thap11 (aussi appelée Ronin), une protéine exprimée en grande quantité dans certaines parties du cerveau et notamment les cellules de Purkinje, impliquée dans l’embryogénèse et la pluripotence des cellules souches embryonnaires101.

Figure 28. Aperçu des différentes protéines identifiées lors des expériences de pull-down

En conclusion, on s’aperçoit que selon la nature du tissu étudié, on observe différents profils de protéines se liant aux bases modifiées de l’ADN. Les interactions entre 5hmC et les protéines sont donc régulées dynamiquement au cours du développement et de la différenciation. Les méthodes employées dans les expériences de protéomique ne permettent cependant pas de distinguer entre les protéines se liant directement aux bases modifiées et celles présentes dans des complexes interagissant avec ces bases. De plus, la nature des liaisons observées peut être dépendante de la séquence d’ADN dans laquelle on introduit les bases modifiées. De nombreuses études sont donc encore nécessaires pour identifier l’ensemble des protéines interagissant avec la 5hmC, la 5fC et la 5caC et les mécanismes qui régissent ces interactions.