10. Projet de thèse
2.3 Etude de stabilité des duplexes étudiés
Nos oligonucléotides comportent plusieurs modifications chimiques sur les deux brins et nous avons vérifié dans un premier temps que leur présence ne déstabilisait pas la formation des duplexes. Ainsi, nous avons évalué leurs stabilités respectives par deux types d’expériences :
- d’une part, par des expériences de gel retard
- d’autre part, par des mesures de température de fusion de l’ADN.
2.3.1 Expériences de gel retard
Le principe de ces expériences est le suivant : le brin portant la sonde photoactivable est radiomarqué en position 5’ en présence de polynucléotide kinase et de 32P-ATP et purifié sur un gel d’acrylamide dénaturant (15% acrylamide, 7M urée). On ajoute à cet oligonucléotide dont la concentration est constante (10 nM) des concentrations croissantes de l’oligonucléotide complémentaire « froid ». Après avoir été chauffés à 95°C pendant 5 minutes, les échantillons sont laissés refroidir à température ambiante pendant au moins trois heures. Les échantillons sont ensuite séparés par migration électrophorétique sur un gel natif d’acrylamide 10% à 25°C. Le duplex formé étant plus lourd que le simple brin radiomarqué, il va migrer plus lentement sur le gel d’acrylamide. La figure 120 représente les autoradiogrammes de différentes expériences avec les duplex comportant les quatre agents de photomarquage ainsi qu’un duplex contrôle non modifié.
Figure 120. Etude de la stabilité des différents duplex par retard sur gel.
A partir de la mesure des quantités de complexe retardé par rapport à celles des bandes non retardées aux différentes concentrations, des valeurs de C50 ont été calculées pour chaque duplex et sont reportées dans le tableau 6.
Duplex C50 (nM) Cds-16-Bzp-Biot 6.5 ± 1.1 Cds-16-Dzr-Biot 5.8 ± 0.2 Cds-17-Iodo-Biot 4.8 ± 0.9 Cds-17-Thio-Biot 9.0 ± 1.5 Cds-Ctrl-Biot 4.7 ± 0.5
Tableau 6. Valeurs des C50 obtenues pour les différentes sondes. C50 est la concentration d’ADN complémentaire à laquelle 50% du duplex est formé dans les experiences de gel retard.
Le duplex contrôle (Cds-ODN-Biot) présente comme attendu une C50 autour de 5nM, la concentration du brin radiomarqué étant de 10 nM. La présence de l’atome d’iode à la position C5 de l’uridine ne semble pas avoir de conséquence sur la formation du duplex, ce qui est cohérent avec la similarité de l’encombrement stérique de l’iode et du groupement méthyle. L’introduction d’un groupement benzophénone ou diazirine déstabilise partiellement
la formation du duplex, l’effet étant plus marqué avec la benzophénone. Étonnamment, l’introduction d’une 4-Thio-2’-désoxythymidine semble déstabiliser de façon plus importante la formation de duplex. Cette déstabilisation a déjà été rapportée par d’autres groupes de recherche223.
2.3.2 Expériences de température de fusion
La dénaturation thermique d’un duplex d’ADN entraine un changement des propriétés spectroscopiques de celui-ci, et se traduit notamment par une absorbance différente. Si l'on chauffe progressivement une solution d'ADN double brin et si l'on suit la densité optique à 260 nm en fonction de la température, on constate une augmentation importante de la densité optique comprise entre 20 et 30%. Cet effet est appelé effet hyperchrome. Il est dû à la séparation des deux brins de la double-hélice par rupture des empilements des bases et des liaisons hydrogène interchaînes : on parle de fusion de l'ADN.
Cette propriété a été exploitée pour mesurer un paramètre de l'ADN, sa température de fusion, ou Tm. La courbe de densité optique en fonction de la température a une forme sigmoïdale ; elle permet de déterminer un point de transition, la Tm, qui correspond à la température à laquelle les molécules d'ADN sont à dénaturées (température de demi-dissociation, Figure 121). La Tm dépend de la longueur du polymère, de la composition en bases (plus la teneur en paires GC d'un ADN est grande, plus la Tm est élevée) et de la force ionique des solutions (la présence de cations stabilise l'ADN, ce qui induit une augmentation de la Tm).
Figure 121. Courbe caractéristique permettant de définir la Tm d’un duplex d’ADN (Tiré de
Le tableau 7 récapitule les températures de fusion des différents duplex que nous avons mesurées, afin d’évaluer l’effet de l’introduction de nos modifications sur la stabilité des sondes.
- L’introduction d’une biotine à l’extrémité 3’ d’un des brins du duplex n’a pas d’effet stabilisant ou déstabilisant sur la formation du duplex, comme on peut le constater en comparant les Tm des duplex Cds-17-Iodo-Biot (73.9°C) et Cds-17-Iodo (73.7°C).
- La comparaison du duplex contrôle Cds-Ctrl avec les duplex comportant un groupement photoactivable indique que l’introduction d’une trifluorométhylphényldiazirine, d’une 4ST ou d’un 5IdU ne déstabilise pas les duplex formés. En effet, leurs Tm sont très proches, la différence maximale ne dépassant pas 0.3°C. Cependant, l’introduction d’une benzophénone a un léger effet déstabilisateur: la Tm de Cds-16-Bzp-Biot diminue de 1.7°C par rapport à celle du contrôle.
- L’introduction d’une 5mC ou d’une 5hmC dans un duplex standard ne déstabilise pas celui-ci, comme on peut le constater en comparant les Tm des duplex Cds-Ctrl, Mds-Ctrl et Hds-Ctrl. Ces résultats sont en accord avec les données de la littérature37.
Duplex Tm (°C) Cds-16-Bzp-Biot 72 Cds-16-Dzr-Biot 73.8 Cds-17-Iodo-Biot 73.9 Cds-17-Thio-Biot 73.4 Cds-Ctrl Hds-Ctrl Mds- Ctrl Cds-17-Iodo 73.7 73.7 73.6 73.7
Tableau 7. Températures de fusions de différents duplex utilisés dans la suite de l’étude
Les deux séries d’expériences pour évaluer la stabilité des duplex convergent donc à l’exception du cas de la 4ST qui, dans le cas de l’expérience de retard sur gel semblait indiquer une légère déstabilisation. Les modifications que nous avons introduites dans nos oligonucléotides impactent peu la stabilité des duplex et semblent appropriées pour des applications de photomarquage.
Nous avons ensuite cherché à mettre au point les conditions de photomarquage avec une protéine modèle.