La symbiose fixatrice d’azote M truncatula/ S meliloti : notre modèle d’étude

Pour les plantes, trouver une source d’azote est une condition nécessaire à leur croissance. La principale source d’azote consiste en l’ammonium ou les nitrates présents dans le sol, provenant soit d’organismes ayant déjà intégré de l’azote, soit de la fertilisation par des engrais azotés. En outre, certaines plantes, notamment celles de la famille des légumineuses (soja, pois, haricot, luzerne, lotier…) sont capables, via une symbiose avec des bactéries fixatrices d’azote collectivement appelées rhizobia, d’être autonomes pour leurs besoins en azote. C’est le cas de la plante Medicago truncatula, qui reçoit l’azote fixé par la bactérie Sinorhizobium meliloti lors de l’interaction symbiotique. En contrepartie, la plante fournit à son symbionte des sources de carbone et une niche écologique.

a) Description des 2 partenaires

Medicago truncatula : Le genre Medicago qui appartient à la famille des légumineuses est

composé de plantes fourragères. L’espèce la plus connue, en particulier pour son importance agronomique est la luzerne ou Medicago sativa. Néanmoins, cette plante n’est pas adaptée pour des études génétiques car elle possède un génome tétraploïde de grande taille et est allogame. C’est pour cette raison que Medicago truncatula, qui a un petit génome diploïde et qui est autogame a été choisie comme modèle d’étude de la symbiose fixatrice d’azote. Son génome de 500 Mb a récemment été séquencé (Young et al., 2011). En outre, cette légumineuse est facilement cultivable et accomplit un cycle de vie complet sur une période relativement courte.

Sinorhizobium meliloti : S. meliloti est une bactérie Gram- qui appartient à la sous-classe α

des Protéobactéries. Cette bactérie, présente dans les sols, est capable de vivre soit libre soit en symbiose avec les légumineuses des genres Medicago, Melilotus ou Trigonella. Le génome de la souche de référence Rm 1021 qui est séquencé, est composé d’un chromosome (3,65 Mb) et de deux mégaplasmides pSymA (1,35 Mb) et pSymB (1.68 Mb). Le chromosome porte l’ensemble des gènes de ménage (Capela et al., 2001). Le pSymA contient une grande

Figure 19 : Les différentes étapes de la symbiose rhizobienne fixatrice d’azote 3- Fixation de l’azote 4- Sénescence Flavonoïdes Facteurs NOD N2 2NH3 Nitrogenase 1- Dialogue moléculaire 2- Infection

-Mort des bactéroïdes et des cellules végétales -Arrêt de la fixation d’azote Légende S. meliloti Primordium nodulaire Cordon d’infection

partie des gènes impliqués dans la symbiose et pSymB porte des gènes codant pour des fonctions de prélèvements de nutriments (transporteurs), d’invasion de la plante (exopolysaccharides) et de réponse aux stress (Barloy-Hubler et al., 2000).

b) La mise en place de l’interaction symbiotique

La symbiose entre M. truncatula et S. meliloti débute par un dialogue moléculaire entre les 2 partenaires (Figure 19). Les légumineuses sécrètent via leurs racines des composés flavonoïdes qui sont perçus par les bactéries. En réponse, S. meliloti synthétise des lipochitooligosaccharides appelés facteurs NOD qui sont reconnus par la plante hôte (Jones et al., 2007).

La perception de ces signaux conduit à la mise en place de la symbiose qui est caractérisée par 2 évènements se déroulant en parallèle : l’infection de la plante par la bactérie et la reprise de divisions des cellules corticales racinaires aboutissant à la formation d’un nouvel organe, le nodule. La bactérie va venir se fixer au niveau d’un poil racinaire de la plante qui en réponse va s’allonger et se courber de façon à emprisonner la bactérie (Figure 19). La bactérie va se diviser pour former une microcolonie. Pour permettre aux bactéries de pénétrer à l’intérieur de la racine, la paroi végétale est hydrolysée localement et au contact de la microcolonie, la membrane cytoplasmique du poil absorbant va s’invaginer pour former une structure tubulaire, le cordon d’infection. Les bactéries dans le cordon d’infection vont poursuivre leurs divisions. Le cordon d’infection qui peut se ramifier, va croitre jusqu’aux cellules corticales qui en parallèle ont repris leur division cellulaire pour former un amas de cellules appelé primordium nodulaire (Figure 19). Cet amas de cellules va grandir pour former un nouvel organe racinaire, le nodule. Par un processus d’endocytose, les bactéries vont être internalisées dans les cellules végétales. Les bactéries appelées bactéroïdes à ce stade se retrouvent donc isolées du cytoplasme, entourées par une membrane d’origine végétale (membrane peri-bactéroïdienne). L’ensemble bactéroïde et membrane péri- bactéroïdienne est appelé symbiosome.

Au sein des symbiosomes, les bactéroïdes vont se différencier en bactéroïdes fixateurs d’azote caractérisés par une endoreduplication du génome, une augmentation de la taille et une perméabilisation de la membrane. La fixation de l’azote par les bactéroïdes est assurée par un complexe enzymatique appelé nitrogénase. Ce complexe est composé de deux sous- unités, la dinitrogénase qui contient le site catalytique et la dinitrogénase réductase qui transfère les électrons à la première sous-unité. La nitrogénase catalyse la réduction d’une

Saccharose Saccharose PEP Malate Glycolyse PEPc CO2 O₂: legHG legHG O2 Malate Chaîne respiratoire CO2 Cycle de Krebs e- ATP N₂ NH3 N2 Nitrogénase

Cellule hôte _Symbiosome

Bactéroïde Phloème NH3 Glutamine Glutamate Xylème Glutamine Synthase (GS) GOGAT

Figure 20: Voies métaboliques lors de la fixation d’azote.

Pour permettre aux bactéroïdes de fixer l’azote, la plante fournit du malate issu de la glycolyse. Le malate va rentrer dans le cycle de Krebs du bactéroïde produisant les électrons et les coenzymes réduits pour la synthèse d’ATP lors de la respiration. L’ATP va être utilisé lors de la fixation de l’azote grâce à la nitrogénase. L’ammoniaque produit va être transporté jusqu’au cytoplasme végétal et être transformé en glutamine grâce au cycle GS-GOGAT. PEP: Phosphoénolpyruvate; PEPc: Phosphoénolpyruvate carboxylase; LegHG: Leghémoglobine.

Racine

Zone I Zone II Zone III Zone IV

Zone V Interzone II/III

endocytose Bt en

division différentiation des Bt

Faisceau vasculaire

Figure 21: Organisation schématique d’un nodule de Medicago truncatula

Le nodule est divisé en plusieurs zones, chaque zone correspondant à une étape du développement du nodule. La zone I est la zone méristématique. La zone II correspond à la zone d’infection où les bactéries libérées vont se différencier en bactéroïdes. La zone III est le lieu de la fixation d’azote par les bactéroïdes. A la base du nodule, une zone de sénescence ou zone IV et une zone V dite zone saprophytique peuvent être observées.

Bt: Bactéroïdes

D’après la thèse d’Yvan Cam 2012

molécule d’azote atmosphérique (N2) en deux molécules d’ammoniaque (NH3) selon la réaction décrite ci-dessus :

N2 + 8H+ + 16 ATP 2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

Cette réaction est très coûteuse en énergie et donc pour permettre aux bactéroïdes de fixer l’azote, la plante fournit du malate issu de la glycolyse. Ce sucre va rentrer dans le cycle de Krebs du bactéroïde produisant les électrons et les coenzymes réduits pour la synthèse d’ATP lors de la respiration (Figure 20). Une fois l’ammoniaque transporté dans le cytosol végétal, il est assimilé via le cycle GS-GOGAT. Ce processus se compose de deux réactions enzymatiques successives. En présence de glutamate, la glutamine synthétase (GS) va permettre la synthèse de glutamine, un acide aminé majeur qui va être redistribué à la plante entière par les vaisseaux du phloème et être assimilé (Figure 20). Le glutamate sera ensuite régénéré à partir de glutamine et de 2-oxoglutarate grâce à la Glutamine-2-OxoGlutarate- Amino-Transférase (GOGAT).

La nitrogénase est sensible à l’oxygène. Par conséquent un environnement microoxique du nodule est absolument indispensable à son fonctionnement. La mise en place d’une barrière de diffusion de l’oxygène dans le nodule permet de limiter l’entrée de l’oxygène à l’intérieur des symbiosomes. Un deuxième contrôle de la concentration en oxygène provient de la présence d’une protéine végétale très abondante dans le nodule, la leghemoglobine. Cette protéine responsable de la coloration rose des nodules fixe l’oxygène libre et le transporte spécifiquement aux bactéroïdes au niveau de la chaîne respiratoire (Figure 20).

L’environnement microoxique du nodule va permettre l’induction d’un grand nombre de gènes bactériens nécessaire à la mise en place et au maintien de la symbiose (David et al., 1988). La perception de la microoxie est assurée par le système à 2 composants FixLJ qui va induire la transcription de deux régulateurs intermédiaires, NifA et FixK (Figure 14, Bobik et al., 2006). NifA est responsable de l’activation de la transcription des gènes nifHDKE codant pour le complexe nitrogénase, et FixK contrôle principalement l’expression de gènes codant pour une oxydase respiratoire alternative hautement affine pour l’oxygène permettant ainsi une respiration efficace malgré les conditions de limitation en oxygène.

Chez M. truncatula, à maturité, tous les stades du développement sont visibles dans les nodules (Figure 21). Ceci est dû à la présence d’un méristème apical persistant ou zone I qui

Etape 1

Etape 2