Etape 2 Cellule végétale non
4) Rôles du NO dans les nodules symbiotiques et importance de la réponse bactérienne au NO pour le maintien de la symbiose
La détection du NO aux différents stades de la symbiose S. meliloti/ M. truncatula et la mise en évidence de systèmes de contrôle du niveau de NO, soulèvent la question du rôle du NO à ces différentes étapes. A l’heure actuelle, seulement quelques publications ont décrit le rôle potentiel du NO dans la symbiose fixatrice d’azote.
Le premier effet du NO sur la symbiose fixatrice d’azote a été constaté en 1982 par Trinchant et Rigaud. Dans cette étude, les auteurs ont montré, in vitro, que la nitrogénase purifiée à partir de Bradyrhizobium japonicum est inhibée par le NO (Trinchant and Rigaud, 1982). Plus récemment, il a été montré que l’addition d’un donneur de NO sur des nodules de lotier conduit à une diminution de l’efficacité de fixation d’azote. En revanche, l’application d’un piégeur de NO supprime l’inhibition de la fixation de d’azote médiée par le nitrate (Kato et al., 2010). De plus, l’effet inhibiteur du NO sur la nitrogénase a été confirmé indirectement par Shimoda et ses collaborateurs qui ont montré que la surexpression d’une hémoglobine non symbiotique du lotier (une protéine qui dégrade le NO) conduit à une augmentation de la fixation (Shimoda et al., 2009). Le mode d’action du NO dans l’inhibition de la nitrogénase reste à élucider. Cependant plusieurs hypothèses sont émises. Tout d’abord, le NO pourrait inhiber l’activité de cette enzyme par S-nitrosylation. En effet, la nitrogénase possède au moins 3 sites de S-nitrosylation potentiels (Xue et al., 2010) et, de façon intéressante, des sous-unités de la nitrogénase ont été identifiées parmi les protéines S-nitrosylées dans des nodules matures de M. truncatula (Puppo et al., 2013). Une autre hypothèse serait que le NO entre en compétition avec l’oxygène pour la fixation à la leghémoglobine. Par conséquent, une augmentation de nitrosyl-leghémoglobine conduirait à une élévation du niveau d’oxygène libre, un puissant inhibiteur de la nitrogénase (Trinchant and Rigaud, 1982 ; Kato et al., 2010).
Une autre enzyme essentielle à la symbiose inhibée par le NO est la glutamine synthétase (GS) végétale (Melo et al., 2011). La GS, qui permet l’assimilation de l’azote, catalyse la réaction entre l’ammonium et le glutamate pour former la glutamine, un acide aminé précurseur de tous les composés azotés (Figure 20). Les auteurs ont montré in vitro, que la GS de M. truncatula est nitratée au niveau de la tyrosine 167 et que cette nitration inhibe l’activité de cette enzyme. In vivo, l’addition d’un donneur de NO sur les nodules entraîne une
augmentation de la nitration de la GS corrélée à une diminution de son activité. L’inhibition de cette enzyme par tyrosine nitration pourrait stimuler les mécanismes anti-oxydants du nodule puisque le glutamate, le substrat de la GS, est aussi un précurseur de la formation du gluthation (GSH), un puissant anti-oxydant (Silva and Carvalho, 2013).
Le NO n’a pas qu’un rôle inhibiteur et délétère pour l’interaction symbiotique. En 2011, del Giudice et ses collaborateurs ont montré que le NO est requis pour l’établissement de la symbiose M. truncatula/ S. meliloti (del Giudice et al., 2011). En effet, la déplétion de NO par l’utilisation d’un piégeur conduit à un retard dans l’apparition des nodules. De plus, une souche de S. meliloti qui surexprime Hmp, une enzyme qui dégrade le NO est moins compétitive qu’une souche sauvage dans la formation des nodules. Par conséquent, le NO jouerait un rôle positif dans les étapes précoces de la symbiose et assurerait deux fonctions. La première serait une fonction de répression des réactions de défense de la plante suite à la perception de la bactérie symbiotique. Cette idée provient d’une étude transcriptomique réalisée sur M. truncatula traitée avec son symbionte, où l’application d’un piégeur de NO active la transcription de gènes de défense de la plante (Boscari et al., 2013). Le NO aurait aussi une fonction dans l’organogénèse du nodule chez M. truncatula et M. sativa, probablement en tant que messager secondaire en aval de la voie de signalisation de l’auxine (Pii et al., 2007). Pour montrer cela, les auteurs ont surexprimé les gènes de synthèse de l’auxine dans une souche de S. meliloti. Cette surexpression, par rapport à des racines inoculées par une souche sauvage, entraîne une augmentation du nombre de nodules de l’ordre de 50 %. De manière intéressante, les nodules induits par la souche surproduisant l’auxine, présentent une augmentation de la quantité de NO par rapport à des nodules sauvages. En revanche, une diminution du NO en traitant les plantes avec un piégeur de NO, provoque une diminution du nombre de nodules. Enfin, bien qu’aucune expérience ne le montre, il a été suggéré que le NO antagonise le burst oxydatif mis en place précocement par la plante lors de la détection de son symbiote. C’est le cas lors de l’interaction symbiotique entre le champignon et le lichen, où le NO synthétisé par le symbionte a un rôle important dans la régulation du stress oxydatif du lichen (Catalá et al., 2010).
Récemment, en 2012, les travaux d’Yvan Cam dans notre équipe ont suggéré que le NO soit un signal local de l’induction de la sénescence des nodules de M. truncatula (Cam et al., 2012). En effet, une augmentation du niveau de NO dans les nodules conduit à une sénescence précoce des nodules et inversement, une diminution de la concentration de NO provoque un retard de la sénescence. Cette étude met aussi en lumière pour la première fois,
le rôle primordial de la réponse de S. meliloti au NO dans le maintien de l’interaction symbiotique. En effet, l’augmentation de la concentration en NO nodulaire à l’origine du phénotype de sénescence précoce des nodules est provoquée par la mutation perte de fonction du gène hmp et inversement, une diminution du niveau de NO à l’origine du retard dans l’apparition de la sénescence des nodules résulte de la surproduction de Hmp (Figure 25). Cette protéine qui a une fonction de dégradation du NO, fait partie du régulon de réponse au NO et la transcription du gène hmp est sous le contrôle du senseur de NO FixLJ via l’intermédiaire FixK (Figure 14). Chez Bradyrhizobium japonicum et Rhizobium etli, il a aussi été montré que la réponse bactérienne au NO est importante dans le contrôle du niveau de NO dans les nodules de soja et de haricots respectivement. En effet, chez ces deux bactéries, en présence de nitrate, la mutation perte de fonction de norC, un gène dont l’expression est induite par FixL (absence de FixJ chez Rhizobium etli), provoque une augmentation du niveau de NO dans les nodules, détectée en dosant les nitrosylleghémoglobines (Gomez-Hernandez et al., 2011 ; Sànchez et al., 2010). Cependant, à l’heure actuelle, aucune modification du phénotype symbiotique n’a été décrite.
Présentation du sujet de thèse
Dans les interactions plante-microorganismes, le NO a été initialement décrit comme une molécule impliquée dans les mécanismes de défense de l’hôte. La découverte du NO dans des interactions symbiotiques et notamment au cours de la symbiose entre M. truncatula et S. meliloti, notre modèle d’étude, soulève la question de comment la bactérie fait face à la toxicité du NO. L’équipe a précédemment montré que la réponse de S. meliloti au NO est essentielle au maintien de la symbiose. Actuellement, seule la protéine Hmp de S. meliloti dont le gène est induit par le NO via le système à 2 composants FixLJ a été identifiée comme un facteur clé du maintien de la symbiose. L’objectif de cette thèse a donc été d’identifier de nouveaux gènes de la réponse bactérienne nécessaire au bon déroulement de l’interaction symbiotique et de caractériser leur rôle en symbiose.
Par ailleurs, il a été montré que le NO joue un rôle positif au cours des étapes précoces et à l’inverse un rôle délétère dans les nodules. L’équipe de recherche à laquelle j’appartiens a suggéré que le NO soit le signal de l’induction de la sénescence des nodules. Les modes d’action du NO dans le processus symbiotique et notamment lors de l’induction de la sénescence des nodules sont à l’heure actuelle inconnus et leur identification constitue un réel
challenge. Un des objectifs de cette thèse a été d’étudier le mode d’action du NO dans l’induction de la sénescence des nodules. Le NO agissant principalement en induisant des modifications post-traductionnelles de protéines, nous nous sommes focalisés sur l’étude de la tyrosine nitration de protéines bactériennes et végétales.