NnrS1 et NnrS2 participent directement ou indirectement à la dégradation du NO dans les nodules symbiotiques

Nous nous sommes ensuite demandé si ces protéines pouvaient aussi avoir un rôle dans le contrôle du niveau de NO dans les nodules symbiotiques de M. truncatula. Une analyse transcriptomique par RNA seq et microdissection de nodules de M. truncatula conduite en 2014 au sein du laboratoire a révélé que les gènes nnrS1, nnrS2 et norB sont exprimés dans les nodules particulièrement en zone III (Roux et al., 2014). Ce résultat suggère que ces 3 protéines, en plus d’un rôle en vie libre, pourraient aussi avoir un rôle dans l’interaction symbiotique. Pour tester cette hypothèse, nous avons inoculé les plantes de M. truncatula avec les mutants nnrS1, nnrS2, norB et hmp (le mutant hmp a déjà été décrit comme étant nécessaire au contrôle du niveau de NO dans les nodules et sert ici de référence) et nous avons ensuite quantifié le NO dans les nodules en utilisant 2 approches distinctes. La première approche est basée sur l’utilisation de souches bactériennes contenant le biosenseur du NO décrit précédemment. Des coupes de nodules obtenus 19 et 26 jours post-inoculation ont été traitées avec le X-gal, un substrat chromogène de la β-galactosidase et nous avons observé la coloration bleue en microscopie optique (Figure 34). 19 jours post-inoculation, les nodules induits par la souche WT sont dépourvus de coloration. Par contre, les nodules induits par chacun des 4 mutants présentent une coloration bleue localisée principalement en zone III pour les mutants nnrS1, norB et hmp et au niveau de l’interzone II/III pour le mutant nnrS2. Plus tard, 26 jours post-inocualtion, les nodules WT présentent une coloration bleue au niveau de l’interzone II/III comme observée à 19 jours pour les nodules induits par nnrS2. Pour les mutants nnrS1, hmp et norB la coloration bleue s’intensifie et reste localisée en zone III. Quant aux nodules induits par le mutant nnrS2, la coloration devient plus éparse et se localise aussi en zone III. L’ensemble de ces observations montre que les nodules induits par les mutants nnrS1, nnrS2 et norB accumulent plus de NO que les nodules sauvages, particulièrement pour nnrS1 et norB qui présentent une forte intensité de coloration.

La deuxième approche de visualisation du NO dans les nodules est basée sur l’utilisation d’une sonde fluorescente perméante spécifique du NO, la DAF-2DA. Grâce à son groupement hydrophobe diacétate (DA), cette sonde va traverser les membranes, puis va être transformée en DAF-2 par l’action d’estérases cellulaires. La sonde DAF-2 va interagir spécifiquement avec le NO pour donner un composé triazole fluorescent, le DAF-T. Nous avons traité des coupes de nodules obtenus 19 jours post-inoculation avec cette sonde et nous avons observé la fluorescence en microscopie confocale (Figure 35). Pour s’assurer de la

0 50 100 150 200 250 14 18 26 Fl uo rescen ce (% d u W T) nnrS1 nnrS2 hmp norB cPTIO

Temps après inoculation (jours)

Figure 36: Quantification du NO dans les nodules en utilisant une sonde fluorescente spécifique du NO non perméante (DAF-2)

Des plantes de M. truncatula ont été inoculées avec S. meliloti WT, nnrS1, nnrS2, hmp ou norB. La production de NO a été mesurée 14, 18 et 26 jours post-inoculation en utilisant la sonde non perméante fluorescente spécifique du NO (DAF-2). Pour contrôler la spécificité de la sonde, 1 mM de cPTIO a été additionné 30 minutes avant l’addition de la sonde dans un puits contenant des nodules WT. La fluorescence est exprimée en pourcentage de la fluorescence obtenue pour des nodules sauvages au temps correspondant. Les données représentent la moyenne de 3 expériences indépendantes réalisées en duplicat. La ligne en pointillée indique la valeur obtenue pour le WT. Les barres correspondent aux erreurs standards. Les moyennes significativement différentes ont été détectées par un test Anova suivi d’un test de comparaison multiple de moyennes appelé test de Tukey. * , ** et *** indiquent une différence significative (P<0.05, P<0.01 et P<0.001 respectivement) par rapport au WT.

***

**

***

_{* ***}

**

***

*** ***

***

*

spécificité de la sonde, quelques coupes de nodules sauvages ont été traitées au préalable avec un piégeur de NO, le cPTIO. Nous observons que les nodules induits par les mutants nnrS1 et norB présentent une forte fluorescence par rapport aux nodules sauvages ce qui confirme qu’il y a une accumulation de NO dans ces nodules. Pour les nodules élicités par nnrS2, 19 jours post-inoculation, il n’y a pas de différence majeure avec les nodules sauvages ce qui est en faveur d’une moindre implication de NnrS2 dans le contrôle du niveau de NO.

Les 2 approches décrites ci-dessus sont qualitatives. Pour quantifier le NO dans les nodules, nous avons utilisé une méthode basée sur l’utilisation d’une sonde fluorescente spécifique du NO non perméante, la DAF-2. Le principe de l’expérience consiste à disposer des nodules entiers dans un puits d’une plaque contenant un tampon phosphate additionné de la DAF-2. Le NO va diffuser dans le milieu et interagir avec la sonde pour donner un signal fluorescent quantifié par un lecteur de plaque à fluorescence. La quantité de NO libérée dans le milieu étant proportionnelle à celle présente à l’intérieur des nodules, cette expérience permet de quantifier le NO dans les nodules induits par les différentes souches. La figure 36 représente la fluorescence (exprimée en pourcentage de la fluorescence mesurée dans les nodules sauvages) en fonction des différents génotypes bactériens et à différents temps (14, 18 et 26 jours après inoculation. Pour s’assurer de la spécificité de la sonde, des nodules sauvages ont été au préalable traités avec le cPTIO, un piégeur de NO. Dans ce cas, la fluorescence obtenue représente 40 % de celle mesurée du sauvage et la valeur est constante en fonction du temps. 14 jours post-inoculation, nous observons que les nodules induits par le mutant nnrS1 présentent une fluorescence environ 40 % supérieure à celle mesurée dans les nodules induits par la souche sauvage. Ce résultat suggère que le niveau de NO dans les nodules occupés par la souche nnrS1 est plus important que celui présent dans les nodules WT. Plus tardivement, à 18 jours, les nodules induits soit par hmp soit par norB montrent une augmentation de la fluorescence par rapport aux nodules sauvages. Enfin, 26 jours après inoculation, les nodules des plantes inoculées avec le mutant nnrS2 présentent aussi une augmentation de la fluorescence. Ces résultats confirment les résultats précédents quant aux rôles de NnrS1, NnrS2 et NorB dans le contrôle du niveau de NO et démontrent que ces protéines en plus d’agir en vie libre ont un rôle dans les nodules symbiotiques.

En conclusion, nous avons identifié 3 protéines de S. meliloti impliquées dans le contrôle de la quantité de NO dans les nodules symbiotiques : NnrS1, NnrS2 et NorB. Ces protéines qui participent aussi à la résistance au NO en culture, ont une activité directe ou

0 25 50 75 100 0 10 20 30 40 N odul es sén escen ts (%)

Temps après inoculation (jours) WT nnrS1 nnrS2 hmp norB

WT

nnrS1

nnrS2

hmp

norB

Figure 37: Cinétique d’apparition des nodules sénescents sur les racines de plantes inoculées avec différentes souches de S. meliloti

A- Observations à la loupe binoculaire de nodules induits par les souches WT, nnrS1, nnrS2, hmp ou

norB 22 jours post-inoculation. Les accolades

délimitent la zone verte. B- Suivi de la sénescence des nodules au cours du temps exprimée en pourcentage du nombre total de nodules. Un nodule est considéré comme sénescent lorsqu'il présente une base verte. Les données représentent la moyenne des valeurs obtenues pour 3 expériences indépendantes. Chaque expérience comporte une série de 10 plantes pour chaque génotype bactérien. Les barres correspondent aux erreurs standards. A 21, 24 et 31 jours post inoculation un test statistique d’Anova suivi d’un test de Tukey ont été effectués et des différences significatives (P<0.05) ont été observées entre chaque mutant et le WT.

A

B

WT

nnrS1

nnrS2

Figure 38: Observations microscopiques de la sénescence des nodules

Des plantes de M. truncatula ont été inoculées avec les souches WT, nnrS1,

nnrS2, hmp et norB. 20 jours post-

inoculation les nodules prélevés ont été coupés avec un vibratome (2 µm) puis colorés avec du bleu de toluidine. Le bleu de Toluidine permet de mettre en évidence les structures hydrophobes. Les observations ont été réalisées avec un microscope optique. Seuls les résultats obtenus pour les nodules induits par le WT, nnrS1 et nnrS2 sont représentés. L’accolade délimite la zone de sénescence.

indirecte de dégradation du NO. Des résultats préliminaires suggèrent que NnrS1 possède une activité NO réductase.

II)

Les plantes inoculées avec les mutants nnrS1, nnrS2 ou norB