Mise en évidence de nouvelles protéines bactériennes et végétales tyrosine nitratées

Pour déterminer si l’accumulation de NO dans les nodules induits par les différents mutants entraîne une modification par tyrosine nitration d’autres protéines (végétales et/ou bactériennes) nous avons réalisé des profils de tyrosine nitration des protéines solubles de nodules mutants et sauvages par Western blot anti-nitrotyrosine (Figure 46). 20 jours après inoculation, les profils des protéines tyrosine nitratées obtenus pour les nodules élicités par les souches WT, nnrS2, WT pBBR nnrS1 et WT pBBR hmp sont comparables. En revanche, les profils de tyrosine nitration obtenus à partir de nodules occupés par les souches nnrS1, hmp et norB, sont similaires entre eux mais diffèrent sur plusieurs points par rapport aux nodules WT. En effet, plusieurs bandes disparaissent et une nouvelle bande apparaît autour de 33 kDa. Ces résultats suggèrent qu’en plus de la GS, il existe des protéines bactériennes et/ou végétales dont la tyrosine nitration est contrôlée indirectement par les protéines NnrS1, Hmp et NorB.

Nous avons fait le choix de nous focaliser sur les protéines bactériennes et avons simplifié le système en travaillant sur des bactéries en culture pour nous affranchir de la limitation en matériel biologique. Deux cultures de S. meliloti (WT et WT pBBR hmp) en phase exponentielle de croissance ont été traitées pendant 1 heure avec différentes concentrations de donneur de NO (SpNN) et après extraction des protéines solubles, les profils des protéines tyrosines nitratées ont été visualisés par Western blot anti nitro-tyrosine (Figure 47A). La nitro-BSA commerciale sert de contrôle positif à l’expérience. Après traitement avec 70 µM de SpNN, nous observons l’apparition d’une bande présentant une taille proche de 38 kDa et l’intensité de cette bande augmente après traitement de la culture bactérienne avec une plus forte concentration de donneur de NO (110 µM de SpNN). Lorsque les bactéries surexpriment hmp (WT pBBR hmp), l’intensité de la bande diminue, ce qui suggère que l’apparition de cette bande est bien due au NO. Pour confirmer que cette bande est bien la conséquence de la tyrosine nitration d’une ou plusieurs protéines, nous avons traité les protéines avec du dithionite de sodium, un agent réducteur des tyrosine-nitrations. Nous avons observé la disparition de cette bande après un traitement avec 110 µM de SpNN. En outre, il est à noter que les bandes de faible intensité visualisées en absence de SpNN correspondent à des interactions aspécifiques de l’anticorps avec des protéines puisqu’après traitement avec le dithionite de sodium elles sont toujours présentes.

Figure 48: Profils des protéines solubles tyrosine nitratées de S. meliloti

A- Des cultures de bactéries WT en phase exponentielle de croissance ou en phase stationnaire (notées Stat) ont été traitées pendant 1 heure avec le donneur de NO SpNN (100 ou 250 µM). Les bactéries ont été lysées et les protéines extraites ont été séparées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE. Après transfert sur membrane, un Western blot anti-nitrotyrosine a été effectué. B- Les protéines extraites d’une culture de bactéries WT en phase exponentielle de croissance ont été traitées pendant 1 heure avec le donneur de NO SpNN (100 ou 250 µM). Les protéines ont ensuite été séparées par électrophorèse sur un gel SDS PAGE et après transfert sur membrane, un Western blot anti-nitrotyrosine a été effectué.

Les profils sont représentatifs de 2 expériences indépendantes.

Stat 40 35 70 55 25 100 15 170 130

Cultures traitées avec le donneur de NO

Extraits protéiques traités avec le donneur de NO

A

B

La microaérobie prévalant dans les nodules, nous avons testé si la bande de 38 kDa était toujours présente et si d’autres apparaissaient lorsque les bactéries étaient cultivées en microaérobie. Suite à un traitement avec la SpNN et en microaérobie, nous avons détecté la bande à 38 kDa. Cependant aucune nouvelle bande n’est apparue.

L’ensemble de ces résultats nous a permis de conclure que suite à un traitement avec un donneur de NO, au moins une protéine soluble de S. meliloti est tyrosine nitratée. Dans le but de déterminer si cette protéine est néosynthétisée en présence de NO puis tyrosine nitratée, nous avons aussi réalisé un profil des protéines tyrosines nitratées mais cette fois ci en traitant non plus les cultures avec le donneur de NO, mais les protéines extraites (Figure 47B). Les protéines ont été traitées soit avec la SpermineNONOate (75 µM) soit avec le peroxynitrite (1 et 3 µM). Ce dernier qui est issu de l’association de l’ion superoxyde (O2.-) et du NO serait le principal agent d’induction de la tyrosine nitration. Nous avons observé la présence de la bande d’environ 38 kDa suite au traitement avec la SpNN et le PN démontrant que cette protéine n’est pas néosynthétisée en présence de NO.

En renouvelant l’expérience, mais cette fois en traitant les cultures de bactéries avec une plus forte concentration de SpNN (250 µM), nous avons observé une nouvelle bande plus diffuse autour de 42 kDa (Figure 48A). Ce résultat suggère qu’il existe au moins une deuxième protéine soluble tyrosine nitratée suite à l’ajout d’un donneur de NO dans le milieu de culture des bactéries. De façon intéressante, la bande est absente lorsque les bactéries ont été cultivées en phase stationnaire de croissance. Au cours de cette phase, les bactéries ont un métabolisme ralenti et synthétisent peu de protéines. Une hypothèse serait que cette deuxième protéine proche de 42 kDa soit néosynthétisée en présence de NO puis tyrosine nitratée. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons réalisé un profil des protéines tyrosines nitratées mais cette fois ci en traitant les protéines extraites avec le donneur de NO (Figure 48B). La bande n’est plus visible, seule celle de 38 kDa est présente. Par conséquent, la protéine (ou les protéines) contenue(s) dans la bande de 42 kDa est/sont néosynthétisée(s) en présence de NO, puis tyrosine nitratée(s).

Pour conclure, suite à un traitement avec un donneur de NO, au moins 2 protéines de S. meliloti sont tyrosines nitratées : une autour de 38 kDa qui n’est pas néosynthétisée en présence de NO et l’autre autour de 42 kDa qui est quant à elle néosynthétisée en présence de NO puis tyrosine nitratée.

Figure 49: Immunoprécipitation des protéines tyrosine nitratées

Des cultures de bactéries WT en phase exponentielle de croissance ont été traitées ou non pendant 1 heure avec le donneur de NO (SpNN 250 µM). Les protéines extraites ont été immunoprécipitées à l’aide de billes couplées à un anticorps monoclonal anti tyrosines nitratées. Les protéines ont ensuite été séparées par électrophorèse sur un gel SDS-PAGE. A- Coloration au bleu de coomassie du gel SDS-PAGE. B- Après transfert sur membrane, un Western blot anti-nitrotyrosine a été effectué sur des échantillons protéiques immunoprécipités ou non.

40 35 70 55 25 100 170 130 15 40 35 70 55 25 100 15 170 130

A

B

3) Vers l’identification par spectrométrie de masse des protéines bactériennes tyrosine