L’anticorps scFv AA2, obtenus par l’équipe de F. Perez est capable d’immuno-précipiter seulement les protéines activés Rab6 sous la forme du mutant Q72L (équivalent du mutant activé Q63L des Rho) (Nizak, Monier et al. 2003). Comme cette équipe, nous avons décidé alors de travailler avec des extraits cellulaires surexprimant les mutants des protéines Rho.
Des cellules NIH 3T3 exprimant de façon stable RhoBWT et ses mutants RhoBV14 et RhoBN19 sont lysées et incubées avec les billes recouvertes du scFv C1N1N2. Après lavage des billes, les complexes protéiques fixés sur celle-ci sont dénaturés et déposés sur gel SDS-PAGE pour être séparés puis transférés sur une membrane PVDF. Les protéines sont ensuite visualisées après incubation de la membrane avec des solutions d’anticorps. Le scFv C1N1N2 semble capable de capter faiblement des protéines reconnues par l’anticorps anti-RhoB après incubation des billes avec les extraits cellulaires surexprimant les mutants RhoBV14 et RhoBN19 (résultats non montrés).
De même des billes recouvertes de scFvs C1N1N2 captent à partir de lysats de cellules exprimant RhoAV14 des protéines RhoA révélées par immuno- empreinte puis incubation avec l’anticorps anti-RhoA. Néanmoins à partir de ces mêmes extraits, ces protéines RhoAV14 sont immuno-précipitées de façon non spécifique par les billes contrôles recouvertes d’un anticorps anti-thyroglobuline. Nous n’avons actuellement pas d’explication convaincante pour comprendre cette réaction.
Commentaires :
Le mutant RhoBN19 est décrit comme étant capable de fixer les GEFs et de conserver la liaison pour empêcher l’activation des protéines Rho endogènes par cette GEF ainsi séquestrée. Ce mutant est vide de nucléotide. La conformation tridimensionnelle de ce mutant peut alors peut-être ainsi être reconnu par le scFv C1N1N2. De plus, les mutants Q63L auraient moins d’affinité pour le
RhoGDI que les mutants V14 et nous n’avons précipité que très peu de mutants V14. En utilisant les mutants Q63L des Rho, peut être aurions-nous eu plus de succès comme l’équipe de Perez qui utilise les mutants Q72L pour montrer la spécificité du scFv AA2 (Nizak, Monier et al. 2003) ?
C.
« His pull down » d’extraits purifiés chargés
Comme le scFv est spécifique des protéines recombinantes activées et comme la captation par « his pull down » des protéines mutantes n’est pas spécifique, nous avons alors cherché à précipiter des protéines recombinantes. Ainsi, des protéines recombinantes RhoA et RhoB purifiées par l’étiquette GST puis clivées de la GST, sont chargées en GTPγS et GDP. Puis elles sont incubées sur des billes Ni-NTA présentant le scFv C1N1N2 ou un scFv contrôle anti- thyroglobuline (protocole décrit dans la partie « matériels, méthodes et optimisation des techniques»). Le complexe formé par les protéines captées par les scFvs est révélé après immuno-empreinte avec les anticorps commerciaux anti-RhoA et anti-RhoB (figure 36). À l’opposé des protéines RhoAV14, les protéines Rho chargées en GDP ou GTPγS ne se fixent pas de façon non spécifique sur les billes portant le scFv contrôle. Les conditions d’incubation et de lavages sont donc suffisantes pour éviter des interactions non spécifiques. De plus, le scFv C1N1N2 précipite spécifiquement les protéines RhoA et
RhoB liées au GTPγS et non pas celles liées au GDP. Nous n’avons pas à
notre disposition d’anticorps efficaces anti-RhoC, donc nous n’avons pas pu faire le contrôle pour cette protéine.
D.
« His pull down » d’extraits cellulaires chargés
Le scFv C1N1N2 est capable de précipiter des protéines recombinantes purifiées et chargées ou sous forme Q63L à partir d’un lysat non purifié (résultats non montrés). Nous avons tenté de capter les protéines Rho endogènes d’extraits cellulaires, chargées suivant les mêmes conditions que pour les protéines Rho recombinantes. Cependant ces protéines Rho potentiellement activées ne se sont pas fixées sur le scFv C1N1N2.
Figure 36: Le scFv C1N1N2 capte spécifiquement les protéines RhoA et RhoB chargées en GTPγS
Les protéines RhoA et RhoB sont chargées avec du GDP et du GTPγS (2 mM) puis incubées avec des billes Ni-NTA présentant les scFvs C1N1N2 et anti-thyroglobuline (contrôle)
pendant 45min à 4°C. Les complexes protéiques fixés sur les billes et une fraction de l’extrait total de protéines chargées non incubé avec les billes sont dénaturés puis déposés sur gel SDS-PAGE et transférées sur membrane PVDF. Les protéines RhoA et RhoB sont révélées après incubation de la membrane avec une suspension d’anticorps de souris anti-RhoA dilué au 1/1000 et de lapin anti-RhoB dilué au 1/5000 puis avec des anticorps secondaires anti- souris et lapin respectivement, couplés à la péroxydase et dilués au 1/10 000. Cette image représente deux expériences indépendantes.
IP scFv - C1N1N2 control Extract total GDP GTPγS GDP GTPγS WB: αRhoB WB: αRhoA
Le chargement des protéines a été contrôlé en incubant les extraits avec des billes
recouvertes du domaine de liaison aux protéines Rho de la Rhotekin (RBD), un effecteur des Rho. Ces billes RBD ont fixé spécifiquement les protéines Rho liées au GTP (résultats non montrés).
Commentaires :
o L’équipe de Ren montre que l’utilisation du deoxycholate sulfate sodique et une forte concentration en NaCl (500mM) dans le tampon de lyse minimisent l’interaction des protéines Rho liées au GTP avec les protéines GAPs et les effecteurs (Ren and Schwartz 2000). Dans d’autres manipulations de « His pull down », nous pourrons tester ces modifications de composition du tampon de lyse pour diminuer les interactions des protéines Rho activées avec leurs effecteurs ou régulateurs et ainsi favoriser la liaison de ces Rho activées avec le scFv C1N1N2.
o L’EDTA est un agent chélateur qui est capable d’extraire les ions nickel de la résine. Dans le protocole fourni avec les billes Ni-NTA, il est précisé que l’EDTA ou l’EGTA jusqu’à 1mM ont été utilisés avec succès dans certains cas mais doivent être utilisés avec précautions. Pour procéder au chargement des protéines Rho, nous incubons le lysat dans 15 mM d’EDTA « libre » (30 mM EDTA compensé par la concentration en MgCl2 du tampon de lyse) complété après
chargement avec 20mM de MgCl2. La concentration « libre » en EDTA du lysat
incubé sur les billes Ni-NTA préparé avec le scFv est de l’ordre de 5 mM. Ces conditions de chargement entraînent peut-être un détachement des scFvs des billes et l’immuno-précipitation est impossible. Le RBD, par contre, est purifié sur des billes recouvertes de glutathion et ces billes ne réagissent pas avec l’EDTA. Ainsi les extraits cellulaires chargés et incubés sur RBD sont immuno-précipités mais pas avec les billes Ni-NTA.
Conclusion du « his pull down » :
Le scFv C1N1N2 précipite spécifiquement les protéines RhoA et RhoB liées au GTP et non pas celles liées au GDP. En augmentant l’affinité du scFv C1N1N2 et en modifiant la composition du tampon de lyse des cellules, nous pensons pouvoir améliorer ses capacités de captation des protéines Rho endogènes activées dans les cellules.
V. Études de marquage avec le scFv C1N1N2 de cellules
fixées
« L’anticorps C1N1N2 » est spécifique des formes actives des Rho. L’objectif est d’utiliser celui-ci sur des tissus tumoraux pour établir s’il peut servir d’outil de pronostic. Avant de tester sa capacité de liaison sur des échantillons de tumeurs montés sur lame, il est nécessaire de le valider sur des cellules humaines cancéreuses activées et fixées.
Dans un 1er temps, nous avons tenté de marquer des cellules surexprimant
les mutants des protéines Rho. Nous n’avons pas réussi à mettre en évidence un signal spécifique sur les cellules surexprimant les mutants V14 par rapport aux cellules surexprimant les mutants WT. En effet, les cellules transfectées avec les mutants WT sont marquées par le scFv C1N1N2 avec la même intensité que les cellules transfectées avec les mutants V14 probablement à cause d’une activation non contrôlée des protéines WT surexprimées. Nous avons alors décidé de travailler avec des cellules non transfectées et activées.
A.
Détermination des conditions de stimulation des
Rho
Le LPA est connu pour activer des voies de signalisation impliquant la protéine RhoA et en particulier, à une concentration de 100µM et à partir de 20 minutes de stimulation, il entraîne la translocation de la protéine RhoA (Fleming, Elliott et al. 1996). La protéine RhoB, elle, est activée à la fois par le LPA (10µM pendant 30 min) et par l’EGF à 100 ng/ml suivant 2 pics de stimulation à 3 et 60 minutes (Gampel and Mellor 2002).
Des cellules HeLa après avoir été privées de sérum pendant 48h sont activées soit avec le LPA (20µM) pendant 3, 10, 30, 60 et 120 minutes ou avec l’EGF à 100 ng/ml pendant 60 minutes. Ces cellules activées et non activées ont été marquées avec une suspension de scFv C1N1N2 et de scFv contrôle anti- thyroglubline (concentration de 0,5 µg/µl). Nous avons observé un marquage spécifique avec le scFv C1N1N2 à partir de 3 min de stimulation au LPA et après 1 heure avec l’EGF et une absence de marquage avec le scFv contrôle (résultats non montrés).
Le scFv C1N1N2 reconnaît, in vitro, les trois protéines RhoA, B et C activées. Nous avons choisi en mélangeant les stimuli, d’activer de nombreuses voies impliquant les protéines RhoA, B (et C ?). Le sérum de veau fœtal (SVF) à 10% est utilisé, par exemple, comme activateur des sondes Raichu de RhoA (présentées dans la partie « outils » de l’introduction). Les cellules HeLa sont normalement cultivées avec 10% de SVF, qui contient du LPA. Ces cellules HeLa cultivées sans sérum pendant 48%, sont alors activées pendant 1h par de l’EGF à 100 ng/ml dans du milieu 10% SVF.
B.
Détermination des conditions de marquage
Suivant les méthodes de marquage par le scFv AA2 de l’équipe de Perez, nous avons choisi par rapport à une procédure classique de marquage, de réduire le temps et la quantité des lavages (Nizak, Moutel et al. 2005). En effet, le scFv C1N1N2 présente une affinité faible et donc peut rapidement se dissocier de sa cible et ainsi il est prévisible de ne pas visualiser de signal spécifique. Le protocole suivi de fixation est précisé dans la partie « matériels, méthodes et optimisation des techniques ».
C.