a) Chargement de RhoA, B et C à partir de lysats frais
Le phage C1 est spécifique de la forme active liée au GTP de RhoA. Comme il reconnaît aussi la forme Q63L de RhoB et RhoC, nous avons contrôlé sa spécificité vis-à-vis des formes chargées en GTP de RhoB et RhoC.
Les conditions de chargement sur extraits frais sont décrites dans la partie « matériels, méthodes et optimisation des techniques ». Nous montrons que le phage C1 se fixe spécifiquement sur les formes de RhoB et RhoC comme de RhoA liées au GTPγS (figure 27). Nous avons vérifié avec l’anticorps anti-GST que la quantité de protéines GST-Rho fixée dans les puits est identique entre les 3 protéines (résultats non montrés).
En conclusion, le phage C1 se fixe spécifiquement sur les protéines
Figure 26: Le phage C1 est spécifique de la protéine RhoA liée au GTP
A : les billes GST-RhoA sont incubées avec 100µM de GDP ou de GTPγS dans de l’EDTA
10 mM pendant un temps variable (jusqu’à 3 heures). Après lavage, 1ml de phages C1 (1011
particules/ml) est incubé avec les billes et les phages fixés sont détectés suivant le principe ELISA au TMB. Les courbes sont représentatives de 2 expériences indépendantes.
B : les protéines GST-RhoA WT et Q63L sont purifiées sur des plaques glutathion. Les
protéines RhoA WT sont incubées avec 100µM de GDP ou de GTPγS (60 min). Après lavage, 100 µl de phages C1 (1011 particules/ml) sont incubés dans les puits et les phages
fixés sont détectés suivant le principe ELISA au TMB. Le graphe représente la moyenne de 2 expériences indépendantes. Q63L GTP!S GDP WT 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
B
A
Figure 27: Le phage C1 est spécifique des formes liées au GTP de RhoA, B et C
Les lysats de GST-RhoA, B et C sont incubés avec 100µM de GDP ou de GTPγS dans de l’EDTA 10 mM (30 min). Ils sont purifiés dans les puits glutathion de plaque ELISA (1h). Après lavage, 100 µl de phages C1 (1011 particules/ml) sont incubés (1h) et les phages fixés
sont détectés suivant le principe ELISA au TMB. Le graphe est représentatif de 3 expériences indépendantes réalisées chacune en duplicate
RhoA
RhoB
RhoC
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
GDP
GTP!S
b) Chargement de Rac1 et Cdc42 à partir de lysat frais
Les protéines Rac1 et Cdc42 sont 2 chefs de files de familles de protéines appartenant à la large famille des protéines Rho (figure 1). Elles sont relativement homologues à RhoA, B ou C (figure 4). Nous avons donc testé la spécificité du phage C1 vis-à-vis des formes activées de ces 2 autres protéines.
Nous incubons les lysats frais bactériens des protéines GST-Rac1, -Cdc42 et -RhoB, avec du GTPγS et du GDP suivant les mêmes conditions que précédemment. Le lysat RhoB sert de contrôle positif de reconnaissance par le phage C1. Ce dernier se fixe, comme attendu, sur la forme liée au GTP de RhoB, mais ne se fixent ni sur les formes liées au GTP ni sur les formes liées au GDP de Rac1 ou de Cdc42 (figure 28-A).
La quantité de GST-Rho fixée dans les puits est contrôlée par un anticorps anti-GST. La quantité de protéine est sensiblement la même dans chacun des puits (résultats non montrés). Cette absence de fixation du phage C1 sur les protéines GTP-Rac1 et GTP-Cdc42 est confirmée par des expériences de fixation sur billes recouvertes de glutathion. Les protéines GST-Rac1 et GST-Cdc42 sont purifiées sur ces billes de glutathion. Des quantités équivalentes de protéines purifiées sur billes sont incubées avec le GDP et le GTPγS suivant le même protocole mis au point avec les billes recouvertes de la protéine GST-RhoA et testées par ELISA. Le phage C1 ne se fixe pas non plus sur ces protéines Rac1/Cdc42 purifiées sur billes et chargées en GTP (résultats non montrés).
c) Mesures par radioactivité de la liaison des nucléides GDP/GTP Nous avons contrôlé que l’absence de liaison du phage C1 n’était pas liée à une inefficacité de fixation du GTP par ces protéines recombinantes Rac1 et Cdc42. Pour vérifier ceci, nous avons mesuré la capacité de fixation spécifique par les différentes protéines Rho des nucléotides GDP et GTPγS radioactivement marqués. Les conditions suivies de chargement des protéines Rac1 et Cdc42 sont les mêmes que celles réalisées pour le chargement des protéines RhoA (Self and Hall 1995). Dans les conditions suivies (décrites dans la partie « matériels, méthodes et optimisation des techniques »), les protéines Rho sont capables de fixer spécifiquement du GTP et du GDP (résultats non montrés).
Figure 28: Le phage C1 ne se fixe pas sur les protéines Rac1 et Cdc42 associées au GTPγS
A : les lysats de GST-Rac1, Cdc42 et RhoB sont chargés et testés suivant le protocole suivi
pour RhoA, RhoB et RhoC (cf légende figure 27). Le graphe est représentatif de 3 expériences indépendantes réalisées chacune en duplicate
B : ces lysats de GST-RhoB, Rac1 et Cdc42 sont incubés avec du [35S] GTPγS seul
(correspond à la radioactivité totale) aux concentrations indiquées ou avec du GTPγS non radioactif à 100µM (correspond à la radioactivité non spécifique) dans de l’EDTA 10 mM (30 min). Ils sont purifiés sur les puits glutathion de plaque ELISA (1h) et la radioactivité fixée est mesurée. La radioactivité spécifique correspond à la différence de la radioactivité totale et de la radioactivité non spécifique. Le graphe est représentatif de 2 expériences indépendantes réalisées chacune en triplicate
A
Sur la figure 28-B, par exemple, Rac1 fixe spécifiquement autant de GTPγS que RhoB (sans augmentation entre les 2 concentrations de radionucléotides incubés). Cdc42 fixe spécifiquement le GTPγS mais plus faiblement que les 2 autres protéines Rho et la fixation spécifique s’élève avec l’augmentation de radionucléotides incubés. Dans les conditions suivies de chargement, les protéines RhoB, Rac1 et Cdc42 fixent le GTP, mais le phage C1 détecte uniquement la protéine RhoB chargée en GTP.
Le scFv C1 porté par le phage C1 est donc spécifique des formes actives des protéines RhoA, B et C (liées au GTP) qui appartiennent à la
sous-famille Rho. Il ne reconnaît pas les autres protéines liées au GTP, Rac1 et Cdc42, chefs de file d’autres sous-familles de la grande famille des protéines Rho.