Avec pour objectif d’améliorer la compréhension de l’implication des petites protéines Rho GTPases dans le développement des cancers, j’ai dans un premier temps, étudié l’action de deux amino-biphosphonates, largement utilisés en clinique dans le traitement des cancers métastatiques de la prostate. J’ai déterminé l’action inhibitrice de ces médicaments sur la voie du mévalonate conduisant à l’inhibition de la géranylgéranylation des protéines Rho et mis en évidence leurs propriétés anti-prolifératives sur des cellules cancéreuses de prostate (Goffinet, Thoulouzan et al. 2006).
La prénylation des protéines Rho permettant de réguler l’activation de ces protéines (Dunford, Rogers et al. 2006), il nous a semblé important d’approfondir ce travail en créant un outil qui permettrait d’évaluer les proportions de protéines Rho activées par rapport à leurs quantités totales. Par la technique du « phage display », nous avons sélectionné un « anticorps », le scFv C1, capable de discriminer les formes actives, c’est à dire liées au GTP des 3 protéines RhoA, B et C par rapport à leurs formes inactives, liées au GDP.
Dans la partie de cette thèse décrivant les résultats obtenus, des commentaires correspondants à des points de discussion plutôt techniques ont parfois été ajoutés. Ici, je vais présenter quelques réflexions et hypothèses permettant de discuter plus globalement des résultats obtenus et je terminerai en présentant les perspectives de travail pour valoriser et utiliser cet outil.
Dans un premier temps, il me semble intéressant de discuter de l’utilisation des mutants des protéines Rho étudiées. L’utilisation des mutants Q63L, présentés comme des mutants mimant la forme activée (Longenecker, Read et al. 2003), exige de respecter des conditions de production et de conservation précises pour obtenir et préserver cette conformation activée. En effet, des résultats préliminaires du laboratoire montrent que la production du mutant Q63L dans E coli nécessite un temps minimum (3h) d’incubation avec l’IPTG pour que la protéine produite présente une conformation tridimensionnelle reconnue par le phage C1. L’intervention de protéines « chaperonnes » nécessaires à l’élaboration de la conformation finale de la protéine (Baneyx and
Mujacic 2004) requiert peut-être un temps minimum de culture après l’induction de la transcription par l’IPTG. De plus, dans des résultats non montrés, il est apparu que le phage C1 se fixe plus sur le mutant Q63L après qu’il ait été incubé avec du GTPγS que s’il n’avait pas été incubé. Le chargement en GTPγS permet-il aux protéines mutantes RhoQ63L produites d’être toutes chargées en GTP ? Ainsi le phage C1 se fixe sur des quantités plus importantes de protéines liées au GTP. D’autre part, dans des résultats préliminaires, la protéine RhoAQ63L semble moins reconnue par le phage C1 après 2h d’incubation de la protéine purifiée dans le tampon de lyse. Préciser le temps de préservation de la conformation activée des mutants Q63L permettrait de mieux définir les conditions optimales pour l’utiliser. Il faut donc manipuler avec précautions ces mutants Q63L qui ne sont pas des protéines figées.
Néanmoins, la sélection sur le mutant RhoBQ63L par phage display nous a permis d’isoler le phage C1, spécifique des formes activées à la fois de la protéine RhoB et des protéines RhoA et C. Nous avons mis en évidence que dans les conditions de chargements utilisées, les protéines Rac1 et Cdc42 fixent spécifiquement du GTP et que même liées au GTP, elles ne sont pas reconnues par le phage C1 (figure 28). L’échange GTP/GDP de ces protéines Rac1 et Cdc42 est régulée par des protéines RhoGEFs, RhoGAPs et RhoGDIs et permet la stimulation d’effecteurs. Il existe des régulateurs et, en particulier, des effecteurs spécifiques des protéines Rac1 et Cdc42 (Bishop and Hall 2000). La structure tridimensionnelle composée des « switchs 1 et 2 » qui est modifiée lors de l’activation de la protéine Rho compose un épitope typique reconnu seulement par sa propre famille d’effecteur ou de régulateurs. Cependant, il a été mis en évidence des effecteurs communs aux protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 comme la phospholipase D, la serine/threonine kinase PKCα et une protéine de liaison à l’actine FlnA (Bustelo, Sauzeau et al. 2007). A l’opposé de ces effecteurs « mixtes », le phage C1 reconnaît spécifiquement les formes actives de RhoA, B et C mais ni de Rac1 ni de Cdc42. Nous pouvons alors avancer que le scFv porté par le phage C1 est spécifique de l’épitope formé par la conformation liée au GTP des seules protéines RhoA, B et C.
Par contre, nous observons, que même si le scFv C1 a été choisi à partir d’une sélection de clones spécifiques de la protéine RhoBQ63L, il semble plus spécifique de la forme activée de RhoA (figures 25 et 27). Le faible degré de différence entre les séquences de RhoA, B et C situé dans et autour du switch 1 (figure 4) permet de suggérer des différences d’affinité pour les protéines régulatrices et les protéines cibles. Peu d’études comparatives ont été menées pour mettre en évidence des activités de ces protéines régulatrices relatives aux trois protéines RhoA, B ou C. Seule la GEF XPLN1 est démontrée comme active exclusivement sur RhoA et RhoB mais pas sur RhoC, protéine dans laquelle un acide aminé empêche l’interaction de Van der Waals avec la GEF (Wheeler and Ridley 2004). De même, il est établi que les effecteurs des RhoA, B et C peuvent être classés en familles suivant la structure de leurs motifs de liaison aux Rho (précisée dans la partie VC : « effecteurs des Rho » du chapitre 1 de
l’introduction). Certains motifs semblent plus affins pour une des protéines Rho (Wheeler and Ridley 2004). De la même façon que l’effecteur Rhophillin interagit préférentiellement avec RhoA par rapport aux protéines RhoB et C, le scFv C1 présente alors peut-être une affinité préférentielle pour la protéine RhoA activée par rapport aux protéines RhoB et RhoC. Ceci expliquerait qu’il se fixe toujours en plus grande quantité sur les formes activées (Q63L ou liées au GTP) de RhoA par rapport aux mêmes formes de RhoB et RhoC (figures 25 et 27).
Cependant, rien ne nous permet de conclure à une différence d’affinité réelle du phage C1 entre ces trois protéines Rho activées. En effet, le phage A8 présentant un scFv avec une séquence différente en acides aminés, se fixe aussi dans des quantités plus importantes sur les protéines RhoAQ63L par rapport aux homologues RhoBQ63L et RhoCQ63L (figure 25). La différence de liaison provient donc plutôt des différences entre les antigènes AQ63L, BQ63L et CQ63L. Des observations du laboratoire montrent que la protéine RhoA, qui est la plus étudiée dans la littérature par rapport à ses homologues RhoB et RhoC, est produite et extraite en plus grande quantité à partir des lysats bactériens. Les bactéries la produisent peut-être plus facilement et la proportion de la protéine mutante AQ63L dans sa conformation tridimensionelle est peut-être en plus grande proportion que celle de ses homologues BQ63L et CQ63L dans leurs conformations tridimensionelles. D’autre part, les protocoles de chargement des protéines Rho ont été élaborés à partir de protocoles permettant le chargement
de RhoA, Rac et Cdc42 et nous n’avons aucun moyen d’estimer la proportion de protéines ayant été effectivement chargées avec le GTP ou le GDP dans nos conditions. Les protéines RhoB et RhoC, dans les conditions suivies, se lient peut-être au GTP dans des proportions plus faibles que la protéine RhoA et nécessiteraient d’autres conditions de chargements pour augmenter ces proportions. La différence de liaison du phage C1 sur les trois protéines RhoA, B et C activées (Q63L ou liées au GTP) provient peut-être des variations de proportions de protéines correctement conformées entre les différents antigènes.
Malgré cette différence de reconnaissance du phage, l’anticorps scFv C1N1N2 est spécifique des formes activées des protéines RhoA, B et C. Ses capacités potentielles d’utilisation ont ensuite été testées. Je présenterai ici les réflexions liées aux problèmes rencontrés pour mettre au point les expérimentations de « His pull down ». En effet, les protéines recombinantes Rho chargées en GTP sont captées par le scFv C1N1N2 alors que les protéines Rho contenues dans les extraits cellulaires et chargées en GTP ne le sont pas. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer cette observation. La présence du prényl associé aux protéines endogènes cellulaires constitue la différence majeure avec la protéine produite chez E coli qui, elle, n’est pas prénylée. Cependant, un traitement des cellules par la lovastatine, bloquant la voie de synthèse des différents prényls, n’a pas permis d’améliorer la captation des protéines Rho des extraits cellulaires. D’autre part, des travaux préliminaires de déphosphorylation des protéines Rho in vitro n’ont pas permis de capter les Rho déphosphorylées avec le scFv C1N1N2. La présence du prényl associé aux protéines Rho cellulaires ou les phosphorylations potentielles des protéines Rho activées n’expliqueraient donc pas l’absence de leurs liaisons au scFv C1N1N2.
D’autre part, nous avons démontré par des études de SPR (figure 33) que le scFv présente une affinité de l’ordre du µM pour les protéines Rho activées. La liaison entre le scFv et l’antigène est une alternance continue entre association et dissociation. L’affinité du scFv étant faible, les mesures d’interaction sont difficiles à déterminer. Les quantités de protéines Rho activées sont peut-être en quantités insuffisantes pour être visibles avec cette technique de « His pull down » avec le scFv C1N1N2. Alors, en augmentant énormément (1000 fois ?) la quantité de scFv C1N1N2 incubé avec l’extrait cellulaire, nous pourrions peut-
être visualiser une fixation spécifique des protéines Rho activées endogènes. Cependant ces quantités de protéines Rho activées sont détectées par la technique du « TRBD » avec le RBD. Ce Rho Binding Domain isolé à partir de l’effecteur Rhotekin (Reid, Furuyashiki et al. 1996), utilisé dans des conditions précises permet de limiter la compétition avec les protéines partenaires des Rho activées (Ren and Schwartz 2000). Cette protéine RBD associée à des billes recouvertes de glutathion permet de précipiter les protéines Rho endogènes chargées qui dans les mêmes conditions ne sont pas captées par le scFv C1N1N2. Ce RBD de la Rhotekin présenterait une plus forte affinité pour RhoA que le RBD de PKN, un autre effecteur (Yoshizaki, Ohba et al. 2003). Néanmoins seules des mesures d’interactions protéines-protéines ont été menées ; les affinités précises des effecteurs pour chacune des Rho n’ont pas été mesurées (Wheeler and Ridley 2004). L’utilisation du domaine de liaisons aux Rho des effecteurs pour des expérimentations de précipitation bloque la liaison des effecteurs endogènes et ne permet pas de précipiter un complexe « protéine Rho / effecteur » (Nizak, Moutel et al. 2005). Cette différence d’efficacité entre le scFv C1N1N2 et le RBD nous permet de poser l’hypothèse d’une compétition de liaison du scFv, du fait de sa faible affinité, par des effecteurs, des protéines régulatrices ou d’autres protéines présentes libres dans le lysat. Par exemple, des effecteurs se liant aux protéines Rho activées peuvent empêcher la liaison des Rho activées aux scFvs C1N1N2. Néanmoins, les protéines recombinantes diluées dans un extrait cellulaire frais sont captées par le scFv C1N1N2 comme dans le tampon ne contenant pas les composés de l’extrait cellulaire. Visiblement la composition de l’extrait cellulaire en protéines régulatrices ou effecteurs ne gêne pas l’interaction du scFv avec les protéines Rho activées. Toutefois dans ces conditions de dilution, les protéines recombinantes ajoutées ne sont probablement pas toutes associées aux protéines régulatrices du lysat car la balance protéines Rho/régulateurs ou effecteurs est déséquilibrée par l’excès de protéines Rho. Il est alors possible que les protéines fixées sur les billes C1N1N2 représentent l’excès incubé de protéines Rho chargées.
D’autre part, la liaison du RBD sur la protéine Rho endogène permet-elle de conserver la protéine Rho sous la forme activée en empêchant l’intervention de protéines régulatrices ? En particulier, le RBD de la Rhotekin est capable d’inhiber l’activité d’hydrolyse du GTP à la fois intrinsèque à la protéine Rho et
provoquée par les RhoGAPs (Reid, Furuyashiki et al. 1996). La liaison du scFv C1N1N2 sur sa cible activée entraîne-t-elle ou non une modification de la structure de l’antigène ? Par exemple en provoquant l’hydrolyse du GTP ou en ne limitant pas cette hydrolyse par l’activité GAP intrinsèque de la protéine Rho, la liaison du scFv entraînerait une modification de la cible supprimant la reconnaissance spécifique par le scFv C1N1N2 lui même. La mesure de l’interaction exige alors peut être une interaction pendant un temps très court pour éviter la dégradation de la cible suite à la liaison de l’anticorps ou à l’intervention des protéines régulatrices.
De la même façon, d’autres protéines, autres qu’effectrices ou régulatrices, disponibles dans le lysat suite aux conditions de lyse peuvent se lier aux protéines Rho par des domaines qui dans la cellule vivante ne sont normalement pas exposés. Ces protéines libres peuvent alors gêner les interactions du scFv C1N1N2 avec les protéines Rho activées.
Même si le scFv C1N1N2 ne semble pas assez puissant pour capter les protéines Rho endogènes activées des cellules, il se fixe spécifiquement sur les cellules dont les voies impliquant les protéines Rho ont été activées. Cette différence peut s’expliquer par les conditions de fixation des cellules. En effet, la fixation par le paraformaldéhyde des cellules entraîne des pontages inter- et intra-protéines. Les protéines partenaires des Rho présentes figées dans la cellule, ne peuvent pas se lier aux protéines activées. Aucune compétition entre les partenaires et le scFv ne peut avoir lieu au moment de l’étude alors que lors d’une incubation du scFv avec un lysat cellulaire, il est possible qu’il y ait compétition permanente entre le scFv et les protéines régulatrices du lysat. De plus, des protéines « parasites » contenues dans le lysat suite à la dégradation par les détergents, ne sont pas présentes dans les cellules fixées et ne peuvent gêner l’interaction comme il est possible qu’elles le fassent pour le « His pull down ».
Néanmoins, le marquage des cellules activées demande à être affiné pour définir quelles protéines Rho sont mises en évidence dans ces marquages. La distribution des protéines RhoA activées a été étudiée dans des cellules Cos1 et NIH-3T3 stimulées respectivement avec l’EGF et le PDGF. En utilisant les sondes « Raichu » (présentées dans la partie « outils » de l’introduction), l’équipe de
Kurokawa montre que l’activité de RhoA diminue rapidement après stimulation par ces facteurs de croissance mais que de façon surprenante, elle persiste dans les repliements membranaires, les « ruffles » (Kurokawa and Matsuda 2005). Dans des cellules exprimant le dominant négatif de RhoA, l’EGF n’induit pas de « ruffles ». RhoA est donc nécessaire à la formation de « ruffles » induit par l’EGF. La localisation de RhoA activé dans les « ruffles » est aussi visible avec ces sondes « Raichu » après une activation par 10% de sérum, (Pertz, Hodgson et al. 2006). Dans nos expériences, les cellules HeLa activées par l’EGF avec 10 % de sérum sont marquées par le scFv C1N1N2 sur des zones ressemblant à des repliements membranaires. Ce marquage correspond-il à un marquage exclusif de RhoA activé ou un marquage associé des 3 Rho activées?
Les marquages que nous obtenons avec le scFv C1N1N2 sont moins précis que ceux obtenus avec les sondes car ils concernent les protéines Rho endogènes et ne sont pas restreints à un membre de la famille Rho. En effet, ces sondes « Raichu », largement utilisées, se limitent à l’étude de la protéine Rho transfectée avec la sonde. Avec le scFv C1N1N2, nous ne pouvons pas définir la protéine Rho activée qui correspond au signal donné. Nous pouvons juste affirmer que les marquages peri-nucléaires et membranaires obtenus sont compatibles avec les marquages des protéines RhoA et RhoB après activation (figures 36 et 37) et avec les observations de la littérature d’un marquage des « ruffles ».
Des expérimentations de suppression de l’expression d’une protéine Rho par ARNi sont envisageables pour rechercher une extinction du signal spécifique. Cependant cette stratégie un temps envisagée a été écartée suite à des expériences du laboratoire montrant par exemple que l’extinction de RhoA augmente l’expression de RhoB.
La spécificité de l’anticorps sélectionné in vitro sur un antigène présentant une conformation tridimensionnelle, a été contrôlée dans des modèles in vivo dans lesquels sa structure ou son association avec d’autres protéines peuvent gêner son interaction spécifique. La nécessité du transfert des études in vitro dans des études in cellulo est affirmée par un travail sur la prénylation de la protéine Rab et de l’importance de sa capacité d’hydrolyse du GTP (Wilson, Sheridan et al. 1996). Cette équipe montre qu’in vitro, l’enzyme GGTase
responsable de la géranylgéranylation de la protéine Rab1B sauvage ne permet pas la géranylgéranylation de cette protéine Rab1B sous la forme du mutant Q67L. Cependant dans l’étude transférée dans un modèle in cellulo, cette différence d’activité de la GGTase par rapport à son substrat sauvage et muté n’existe plus. Dans nos travaux, les problèmes rencontrés avec la technique du « His pull down » montrent la difficulté des transferts d’études sur les protéines recombinantes à des études sur des protéines cellulaires. Néanmoins l’efficacité du marquage des cellules fixées par ce scFv C1N1N2 confirme son potentiel pour des études complémentaires sur des tissus humains fixés.
Dans le but d’améliorer la fonctionnalité du scFv C1N1N2 tels que son affinité ou sa stabilité, notre équipe cherche maintenant à exprimer le scFv C1 sous forme de Fab. La transformation de scFv en Fab (structures représentées sur la figure 19) est connue pour améliorer la stabilité de l’anticorps (Kramer, Fiedler et al. 2002) et pour augmenter les activités physiologiques d’anticorps neutralisants de toxines (Quintero-Hernandez, Juarez-Gonzalez et al. 2007). Nous espérons que sous cette forme Fab, les conditions de l’utilisation de cet « anticorps C1 » seront facilitées (par liaison sur la protéine A, par exemple). D’autre part, nous effectuons de la mutagénèse aléatoire sur la séquence du scFv C1 pour rechercher un ou d’autres clone(s) ayant une plus forte affinité pour les formes actives des protéines Rho. Cette technique de mutagénèse aléatoire a déjà montré sa capacité à améliorer l’affinité de certains scFvs (Hawkins, Russell et al. 1992; Daugherty, Chen et al. 2000; Suzuki, Ito et al. 2005).
En parallèle, nous souhaitons identifier l’épitope reconnu par le scFv C1N1N2. Cet anticorps est spécifique des trois protéines RhoA, B et C. C’est pourquoi, nous pensons que l’hélice A 3’ spécifique de cette sous-famille doit constituer une partie de l’épitope de reconnaissance (figure 4). En effet, la séquence en acides aminés de cette hélice est différente dans les autres protéines Rho (absente chez Ras) et en particulier Rac1 et Cdc42 qui ne sont pas reconnues par le scFv. La spécificité par rapport à la forme activée doit être liée à un changement de conformation des « switchs 1 et 2 » qui fait suite à l’échange du GDP en GTP. Ces changements de conformation sont déjà identifiés comme étant nécessaires à la liaison des effecteurs et des protéines régulatrices.
Pour identifier précisément l’épitope reconnu par le scFv, nous avons pris contact avec un bio-informaticien, le Dr David Allouche, à l’INRA- Auzeville. La protéine RhoA est déjà cristallisée sous forme liée au GDP et au GTP (Ihara, Muraguchi et al. 1998). Nous souhaitons, alors, comparer les structures tridimensionnelles de surface des trois protéines Rho liées au GTP et au GDP. En effet, le paratope du scFv C1 reconnaît une structure typique de la forme liée au GTP des Rho commune aux trois protéines. Ainsi, les épitopes communs des trois formes actives, déduits à l’aide de la comparaison des structures modélisées, seront testés grâce à des expérimentations de mutagénèse dirigée sur les séquences des Rho, suivies de tests ELISA sur ces nouveaux mutants avec le phage C1. De la même façon, nous espérons distinguer les épitopes typiques de chacune des Rho. Ainsi, nous identifierons peut-être l’épitope de reconnaissance du scFv C1N1N2 pour les trois protéines Rho activées et nous obtiendrons aussi peut-être un épitope correspondant à la forme activée d’une protéine Rho par rapport aux