Les conditions de purification

a) Principe de la purification sur billes Ni-NTA

Les scFvs C1N1N2 contenus dans les lysats sont purifiés grâce à l’étiquette 6xHis par chromatographie d’affinité sur des billes d’agarose recouvertes de nickel. Nous avons, dans un 1er _{temps, suivi le protocole décrit par le fabricant}

QIAGEN: « A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins ». Les protéines sont purifiées par affinité de l’alignement des 6 acides aminés histidine du scFv et le nickel-nitriloacetic acid (Ni-NTA) des billes. L’imidazole (concentré jusqu’à 250 nM) en entrant en compétition avec l’étiquette 6xHis du scFv dans le site de liaison au Ni-NTA permet l’élution des protéines purifiées sur les billes.

b) Adaptation du protocole à la purification du scFv C1N1N2 En suivant le protocole fourni, les scFvs étaient retrouvés en grande quantité dans les tampons de récupération des lavages. Nous avons alors dû adapter ce protocole à la production du scFv C1N1N2. En effet, nous avons

diminué la concentration de l’imidazole dans le tampon d’interaction du scFv avec les billes Ni-NTA de 10 à 1 nM et la concentration de l’imidazole dans les tampons de lavages de 20 à 10 nM. Le protocole suivi en système de « batch » est détaillé dans la partie « matériels, méthodes et optimisation des techniques».

La perte du scFv C1N1N2 dans les tampons de lavage rend compte d’une faible capacité de liaison de celui-ci sur les billes Ni-NTA. Cette liaison fragile peut s’expliquer par le fait que l’étiquette 6xHis est probablement rendue moins accessible pour sa liaison au Ni-NTA à cause de la construction en fusion avec N1N2. En effet, l’ajout de la partie N1N2 de la pIII à la suite des étiquettes de purification du scFv entraîne « le déplacement » au centre de la molécule du scFv C1N1N2, des étiquettes 6xHis et c-myc en position C-terminale dans le scFv originel. D’autre part, un logiciel disponible sur Internet fourni par l’EMBL permet à partir de la séquence en acides aminés d’estimer le point isoélectrique (Pi) de la protéine correspondante. Nous avons demandé le calcul du Pi à partir de la séquence contenant les étiquettes c-myc et 6xHis et le « peptide signal ». En effet, les scFvs sont extraits à partir du lysat bactérien complet et donc on ne retrouve qu’une faible proportion de protéines dont le « peptide signal » a été protéolysé dans le périplasme. Les résultats indiquent que le scFv C1 possède un Pi de 6,2 et le scFv C1N1N2, un Pi de 4,8. La fusion N1N2 a abaissé la valeur de son point isoélectrique. Cette variation entraîne peut-être des modifications dans les interactions protéines-protéines et dans les interactions du scFv avec le Ni.

c)Résultats de l’enrichissement:

Les extraits protéiques isolés à partir des étapes de la purification sont séparés sur gel SDS-PAGE et colorés au bleu de Coomassie. Sur un exemple d’une purification (figure 32-A), nous pouvons observer dans le lysat (crude) la présence d’une bande à 60 kDa. Cette bande disparaît dans le surnageant non fixé sur les billes (flush). À partir de la 2ème _{élution à 250 nM, cette bande}

réapparaît. Dans la 3ème _{élution, elle est encore plus concentrée puis sa}

concentration diminue dans la 4ème _{élution. Cette purification correspond à un}

profil classique de purification en système « batch». La purification à partir du périplasme seul fournit un rendement 4 fois moins important que celle à partir

Figure 32: Le scFv C1N1N2 est purifié sur des billes Ni-NTA et les élutions sont spécifiques de la forme Q63L de RhoA

A : le lysat de scFvs C1N1N2 (crude) (10 ml) est purifié sur billes de NI-NTA par

chromatographie d’affinité. Des fractions de la purification sont déposées (20 µl) sur gel SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie. Flush : surnageant non fixé sur billes (10 ml);

El 1-4 : élutions de 1 à 4 (500 µl).

B : ces fractions de purification diluées au 1/10 sont testées en ELISA sur RhoA et

RhoAQ63L (cf légende figure 29-B).

Le gel et le graphe sont représentatifs d’au moins 6 expérimentations réalisées en duplicate pour l’ELISA.

crude elution1 elution2 elution3 elution4 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

RhoA

RhoAQ63L

A

B

du lysat total (résultats non montrés). Nous avons donc définitivement écarté l’extraction à partir du périplasme.

Chacune de ces fractions de purification est testée, diluée au 1/10 en ELISA sur les protéines RhoA et RhoAQ63L fixées sur des plaques (figure 32-B). La quantité d’anticorps scFvs fixés spécifiquement dans les puits RhoAQ63L est proportionnelle à la quantité incubée de scFv purifié.

Commentaires :

De façon systématique, nous observons dans chacune des purifications réalisées la présence d’une protéine migrant autour de 40 kDa suivant le même profil de purification que la protéine de 60 kDa (figure 32-A). Après transfert sur membrane des gels de purification et révélation des protéines contenant l’étiquette c-myc, ces bandes à 60 et 40 kDa sont révélées (figure 29-A). Nous n’avons pas clairement identifié la nature de cette protéine «contaminante» de 40 kDa qui possède donc un site de liaison aux billes Ni-NTA et une étiquette c- myc, mais il serait possible d’enrichir la suspension en l’une des 2 protéines par HPLC pour tester quelle fraction est active. Pour expliquer sa présence, en plus de l’action d’enzymes protéolytiques, nous proposons quelques hypothèses :

1. Dans les organismes, il existe un mécanisme d’épuisement des ARNt spécifiques de certains codons (Sorensen and Mortensen 2005). Une liste de ces codons rares est référencée pour les bactéries E coli dans le logiciel Enzymix. Par exemple, un codon rare codant une cystéine débute au nucléotide 1027 de la séquence du scFv C1N1N2. Si l’ARNt correspondant à ce codon n’est plus disponible dans la bactérie, la traduction de la protéine est stoppée et il est possible d’obtenir une protéine d’une taille autour de 40 kDa. Mais ce n’est qu’un exemple. En effet, sur les 100 acides aminés situés dans la zone entre le N1 et le N2 pouvant entraîner un arrêt de traduction donnant une protéine de 40 kDa, on trouve 12 acides aminés « proline » et 3 « cystéines » codés par des codons rares. Rien ne peut alors être conclu à propos de ces codons rares.

2. Les souches de bactéries TG1, utilisées pour la production des scFvs, ne contiennent pas d’inhibiteurs des enzymes « recombinases » du complexe SOS impliqué dans la réparation de l’ADN. L’action des recombinases peut entraîner la formation de plasmides tronqués à partir du plasmide originel introduit dans les

bactéries. Les bactéries utilisées contiennent peut-être un mélange de bactéries possédant de façon aléatoire 1 des deux plasmides codant l’un pour le scFv complet et l’autre pour le scFv tronqué de la partie terminale et donnant une protéine de 40 kDa. Nous pourrions extraire l’ADN plasmidique à partir de ces bactéries utilisées pour la production des protéines et chercher la présence de 2 plasmides de tailles différentes. Pour éviter ce risque d’action de recombinases, il est possible d’utiliser des souches de bactéries recA négative qui limitent l’action des recombinases (Sorensen and Mortensen 2005), comme les XL-1.

Comme nous ne sommes pas capables d’affirmer laquelle de ces 2 protéines est responsable de la spécificité de la suspension purifiée testée en ELISA sur les protéines RhoAQ63L, nous conservons l’ensemble de ces protéines enrichies en scFvs C1N1N2.