B. Structure de modules de PKS à moyenne résolution

IV.B.1. Structure d’un module entier par cryo-EM

La structure cryo-EM de la sous-unité PikAIII de la PKS synthétisant la pikromycine chez S. venezuelae est obtenue en 2014. Cette sous-unité ne comporte qu’un seul module, le module 5. Il est composé des domaines de condensation : KS, AT et ACP, ainsi que d’un domaine KR et de deux interfaces de docking assurant l’interaction en trans avec les sous-unités partenaires. Du module 1 Vers le module 4 Module 2 Module 3

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Plusieurs structures correspondant à différents stades de la catalyse ont été obtenues entre 7 et 11 Å de résolution. Les structures à haute résolution de domaines homologues ont été replacées dans les cartes obtenues. La première étude (Dutta et al., 2014) a été réalisée alors que l’ACP du module était sous forme holo, c’est-à-dire modifié par le bras phosphopantéthéine (Figure 29 page 50).

Figure 29 : Structures cryo-EM de PikAIII sous forme holo (tirée de Dutta et al., 2014).

Représentation de la structure cryo-EM de PikAIII en solide ou en transparent avec les structures à haute résolution positionnées au sein de la carte EM. L’ensemble s’agence en une forme d’arche, le domaine KS homodimérique formant le dôme et les domaines AT et KR se positionnant consécutivement en dessous. L’ACP (en orange) se trouve en contact soit avec le domaine KR (en violet) (conformère 1) ou avec le domaine AT (en vert) (conformère 2).

Contrairement à ce qui était pensé jusqu’alors, ce module présente une forme d’arche symétrique ne comportant donc qu’une unique chambre réactionnelle, les sites actifs des domaines catalytiques faisant face à cette chambre. Les domaines AT et KR sont positionnés à

la suite, en dessous de la KS homodimérique. Cette disposition entre les domaines KS et AT est totalement différente de celle obtenue dans les structures cristallographiques de didomaines issus de DEBS (Figure 27 page 48) (Tang et al., 2006 ; Tang et al., 2007). Les domaines ACP sont clairement visibles, et occupent deux postions différentes : proches du domaine KR (conformère 1) ou proches du domaine AT (conformère 2). De plus, ils occupent ces positions équivalentes simultanément, ce qui suggère qu’ils se déplacent ensemble au sein de l’arche, contrairement à ce qui est supposé pour les ACP de la mFAS (Brignole, Smith, et Asturias, 2009).

Les auteurs se sont aussi intéressés aux changements conformationnels du module nécessaires à la réalisation du cycle d’élongation/réduction (Whicher et al., 2014). Pour cela, des domaines ou des combinaisons de domaines ont été tour à tour modifiés de manière à mimer chaque étape du cycle catalytique. Des cartes des modules ainsi bloqués ont été ensuite obtenues par cryo-EM (Figure 30 page 52).

La première étape du cycle d’élongation/réduction de PikAIII consiste à charger la KS5

par l’ACP du module précédent, l’ACP4. Pour comprendre comment la KS5 discrimine entre l’ACP4, avec lequel elle interagit en trans, de l’ACP5, avec lequel elle interagit en cis, une protéine de fusion ACP4-PikAIII(∆ACP5) a été analysée. Cette protéine ne contient pas l’ACP5

qui pourrait interférer dans l’interaction entre l’ACP4, qui lui était modifié par un substrat pentacétidique, son ligand naturel. De manière à bloquer le transfert de ce pentacétide, la cystéine catalytique de la KS5 a été mutée. Les cartes cryo-EM obtenues ont révélées que l’ACP4

interagit avec la KS5 à l’entrée de son site actif, dans une configuration telle qu’il demeure à l’extérieur de l’arche formée par le module (conformation 1-2, Figure 30 page 52). De cette manière, la KS serait en mesure de discriminer entre les ACP et d’éviter les mauvais transferts. En l’absence du pentacétide fixé à l’ACP4, le domaine holo ne contacte pas la KS5, ce qui suggère que la présence du substrat est nécessaire à l’établissement d’une interaction stable. Pour mimer l’étape suivante, la KS5 a été acylée spécifiquement par l’intermédiaire pentacétidique, et l’ACP5 maintenu sous forme apo. Cet état serait loin d’être révélateur du phénomène physiologique, puisque de nombreuses données démontrent que les domaines ACP et AT sont constamment chargés par des unités d’extension in vivo (Dunn et Khosla, 2013 ; Hong, Leadlay, et Staunton, 2009). En effet la structure rapportée montre l’ACP5 en complexe avec le domaine AT5, sa sérine catalytique pointée vers le site actif de l’AT5 (conformation 2 Figure 30 page 52), ce qui pourrait correspondre à une réponse de détresse du module favorisant le chargement rapide de l’unité d’extension. De plus, il est étonnant que la KR5 procède à une

Introduction

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Figure 30 : Conformations adoptées par PikAIII au cours du cycle d'élongation/réduction (adaptée de Whicher et al., 2014).

Le domaine KS5 homodimérique est représenté en bleu (sa cystéine catalytique est symbolisée par une étoile), l’AT5 en vert, la KR5 en violet, l’ACP4 en rouge et l’ACP5 en orange. Par soucis de clarté, seul un ACP5 est représenté.

Ensuite les auteurs ont assuré le chargement de l’ACP5 avec l’unité d’extension, le méthylmalonate, grâce à l’activité naturelle de l’AT5. Dans la structure résultante, l’ACP5 holo pointe le substrat vers le site actif de la KS5 (conformation 3 Figure 30 page 52) et son site d’interaction est à l’opposé de celui de l’ACP4. Au vu des surfaces d’interaction de ces deux ACP, aucune gêne stérique ne serait engendrée par la présence de l’un ou l’autre, rendant possible une interaction simultanée des deux domaines sur la KS5. Ceci pourrait expliquer les transferts directs ACP-ACP observés dans des systèmes PKS modifiés, résultant en un « évitement » de module (Figure 22 page 37) (Thomas et al., 2002).

L’étape suivante de la catalyse étant la condensation du méthylmalonate et du pentacétide, les auteurs ont laissé incuber l’ACP5 holo avec la KS5 modifiée au niveau de sa cystéine catalytique par le pentacétide. Ceci a mené à l’obtention d’un ACP5 chargé par un β -cétohexacétide (conformation 4 Figure 30 page 52). Dans cette configuration, l’ACP5 interagit

two consecutivea-helices, and a C-terminal dockinga-helix.48,49

This module was presumably chosen, at least in part, because it is discrete, which obviated the need to dene articial N- and C-termini in order to express it heterologously. Reconstructions of PikAIII in multiple states were obtained at calculated resolu-tions of 7–11 A. At this resolution, it was possible to˚ t the crystal and NMR structures of homologous domains from the DEBS PKS37,38,40 into the EM maps by treating them as rigid bodies, leading to pseudo-atomic resolution structures.

Initial analysis of theholoform of PikAIII (that is, with the ACP modied with phosphopantetheine), yielded the rst surprise: although the subunits were aligned head-to-head and tail-to-tail as expected,22together they form a symmetrical arch. Thus, unlike the two isolated reaction cles predicted by

existing models (Fig. 6),23–25 this topology results in a single reaction chamber, into which all of the domain active sites face (Fig. 7b and c). The base of the arch comprises the homodimeric KS, while the AT and KR, which are positioned consecutively below the KS, form its sides. The conguration of the KS and AT domains resembles that in the double-helical model,22 but is dramatically different from that seen in crystallographic anal-ysis of the isolated DEBS KS–AT domains in which the two domains form an extended, slightly angular structure (Fig. 7d).38,39To arrive at the conguration seen in PikAIII, the KS–AT linker and the AT must rotate a full 120!relative to their previously observed positions, and certain structural elements must also rearrange to relieve steric clashes with the KS. In addition, the newly-observed AT–KR conformation means that a

Fig. 8 Conformational states identi_fied for PikAIII as a function of covalent modi_fication of one or more component domains.18,19The domains are color-coded as in Fig. 7, with the locations of the active sites/residues indicated in yellow. Where appropriate, the structures of the substrates attached to the various domains are shown. The numbers indicate the distance estimated between the catalytic residues of specific domains and the Ser phosphopantetheine attachment point of the ACP. State 1 represents theholoprotein (ACP modified with phosphopantetheine cofactor). In this state, the ACPs (only one is shown for clarity) occupy one of two positions, either adjacent to the KR (57%) or to the AT (43%). State 1–2 represents the conformation which permits transfer of the chain extension intermediate from the upstream module to PikAIII. To allow unequivocal identification of the ACP4domain, ACP5was removed from the construct–thus its location at this stage of the biosynthesis is unclear. In State 2, the KS is now modified with pentaketide intermediate (yellow line), which prompts the ACP to localize near the AT active site. Notably, the KR has_flipped end-to-end with respect to its position in States 1 and 1–2. In State 3, the ACP is now acylated with methylmalonate (as is the AT; red lines), readying it to participate in chain extension with the KS (although in this case, the KS is unmodified). Correspondingly, the ACP now occupies a position below the KS, where it can access the KS's lower active site entrance. Curiously, the KR at this stage is unflipped. State 4 represents the system following chain extension (b-ketohexaketide–ACP), although both the KS and the AT are also modified. At this stage, the ACP is positioned for the next step, ketoreduction, at the KR domain (which resumes itsflipped configuration); from this location, the intermediate (red-yellow line) can be inserted into either side of the active site. Following ketoreduction to generate theb-hydroxyhexaketide– ACP (blue line), the ACP is ejected out of the reaction chamber (State 5), freeing it to engage in chain transfer with the downstream module located on PikAIV. Shown is one of three conformers observed for the module, in which only the position of the ACPs varies relative to the catalytic domains. State 6 (not directly characterized) is the conformation proposed to allow transfer of the intermediate to PikAIV. The posi-tioning of the ACPs on either side of the homodimeric KS would seem to necessitate unraveling of the post-ACP dimerization domain. Adapted from ref. 19.

This journal is © The Royal Society of Chemistry 2015 Nat. Prod. Rep., 2015,32, 436–453 |443

Review NPR

Published on 14 October 2014. Downloaded by Universite de Lorraine on 20/04/2015 13:35:07.

HoloPikAIII

Conformation 1 Conformation 1-2 Conformation 2 Conformation 3

Conformation 4 Conformation 5 Conformation 6 Transfert de chaîne (ACP₄modifié ; KS₅C209A) Chargement de l’ACP₅

avec l’unité d’extension

(KS₅modifiée)

Condensation (AT₅ et ACP₅modifiés)

Cétoréduction (KS₅, AT₅ et ACP₅ modifiés)

Cycle complet (KS₅, AT₅ et ACP₅ modifiés)

avec la KR5 qui a subi une rotation d’environ 180° par rapport au conformère 3, positionnant son site actif à portée du bras phosphopanthétéine.

En incubant la construction précédente avec du NADPH, les auteurs ont obtenu le produit final synthétisé par le module. Une fois la cétone réduite par le domaine KR5, l’ACP5

se place directement sous la KR5afin de faciliter l’échange de la chaine en élongation avec le module suivant (conformations 5 et 6 Figure 30 page 52).

Cette étude permet une contribution majeure à la compréhension des interactions entre le domaine ACP et ses différents partenaires. L’ACP d’un module sonderait de manière aléatoire un partenaire potentiel via des interactions charge-charge complémentaires. Le partenaire spécifique serait sélectionné lorsque son domaine catalytique reconnaîtrait son substrat. Ces interactions supplémentaires permettraient la stabilisation du complexe qui ne serait que transitoire dans le cas contraire (Weissman, 2017).

IV.B.2. Structures d’une construction modulaire et bimodulaire par

SAXS

Deux multi-enzymes ont été analysées au cours de cette étude : la première comprend le module 3 de DEBS fusionné au domaine TE du même système (M3-TE) et la seconde correspond à la sous-unité DEBS 3 comprenant les modules 5 et 6, ainsi que le domaine TE. Tous les modules étudiés comprennent les mêmes domaines : KS, AT, KR et ACP, mais diffèrent selon la construction : l’ACP est suivi soit du domaine TE pour les modules 3 et 6, soit d’une KS homodimérique pour le module 5 (Edwards et al., 2014).

Dans un premier temps, des analyses SAXS ont été menées sur des fragments mono ou didomaines du M3-TE (KS-AT, KR, ACP et TE) pour lesquels des structures à haute résolution sont connues. Puis des courbes de diffusion ont été enregistrées sur la construction M3-TE complète. Par modélisation en corps rigides, trois modèles en adéquation avec les données SAXS ont été proposés, suggérant l’existence de plusieurs états conformationnels en solution (Figure 31 page 54).

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Figure 31 : Modélisations en corps rigides de la construction M3-TE (adaptée de Edwards et al., 2014). Le didomaine KS-AT (en rouge) et le pseudo dimère de KR (en bleu) ont été traités comme des corps rigides durant la modélisation. Les domaines ACP (en violet) sont localisés à proximité du dimère de TE (en vert), quel que soit le modèle généré.

Évidemment, l’organisation générale de ce module est différente de celle du module PikAIII obtenue par cryo-EM. Tout d’abord le didomaine KS-AT présente une conformation étendue ; ceci est certainement dû au fait qu’il est considéré comme un corps rigide durant la modélisation, ainsi la structure de cette région du module est la même que celle du didomaine isolé (Tang et al., 2006 ; Tang et al., 2007). De plus, les domaines ACP sont localisés proches des domaines TE et donc à distance trop importante des sites actifs des domaines KR, KS et AT. Ces divergences d’organisation spatiale peuvent être expliquées par une troncature des données de diffusion à des q faibles (0,15 Å-1), ce qui limite la résolution à 40 Å.

Les données enregistrées sur la construction correspondant à DEBS 3 sont en accord avec une protéine allongée et homodimérique. De manière analogue à la première construction, une modélisation en corps rigides a été menée. Les auteurs ont disposé ainsi les domaines les uns par rapports aux autres en accord avec les données. Globalement, l’organisation des domaines au sein des modules 5 et 6 est la même que celle des domaines de M3-TE (Figure 32 page 55), mais les deux modules, bien que liés covalemment, seraient capables d’une rotation l’un par rapport à l’autre allant jusqu’à 70° le long d’un plan passant par le didomaine KS-AT et les domaines ACP.

Dimère de TE ACP ACP KR KR KS KS AT AT 100 Å A B C

Figure 32 : Modélisations en corps rigides de la construction DEBS 3 (tirée de Edwards et al., 2014).

Le didomaine KS-AT (en rouge), les pseudo dimères de KR (en bleu), les ACP (en violet) et le dimère de TE, ont été traités comme des corps rigides.

Ensemble, ces études structurales permettent de mieux appréhender les interactions spécifiques entre domaines et le transfert de l’intermédiaire d’un site actif à l’autre au sein d’un même module grâce aux domaines ACP. Cependant, bien des questions restent en suspens. D’autres études doivent être menées sur des modules comprenant les autres domaines de modifications : DH et ER. A mon arrivée au laboratoire, aucune structure de modules de PKS

trans-AT n’était disponible, or ces derniers présentent des compositions en domaines atypiques

et très variables. Il était donc intéressant de déterminer l’impact d’une composition alternative en domaines sur l’architecture modulaire.

De plus, les précédents travaux (Dutta et al., 2014 ; Whicher et al., 2014) révèlent l’interdépendance et la grande communication entre domaines d’un même module au cours du cycle d’élongation/modification, ce qui peut expliquer en grande partie le faible taux de succès des expériences d’ingénierie. Il semble donc que l’approche la plus adaptée pour l’ingénierie serait d’échanger directement des modules voire des sous-unités entières de PKS de manière à garantir l’intégrité structurale des modules et une communication efficace entre domaines. Pour ce faire, pourtant, il est impératif de déterminer comment les sous-unités de PKS communiquent ensemble de manière spécifique et sélective afin d’assurer le bon transfert de l’intermédiaire réactionnel. Dimère de TE ACP ACP KR AT AT KS KS ACP ACP KR KR KS KS AT AT 100 Å A _B

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