C. Les trois types de PKS

La catalyse réalisée par ces enzymes complexes repose sur la présence de plusieurs activités. Selon le type de PKS, certaines enzymes ou domaines sont présents. Il est trouvé au minimum des cétoréductases (KS) qui catalysent la réaction de condensation entre les unités acyl-CoA chez les PKS de type III. Chez les PKS de type II est aussi présent un acyl carrier

protein (ACP) qui lie covalemment les intermédiaires de réaction et les achemine au site actif

de la KS. Enfin les PKS de type I sont des multi-enzymes présentant de nombreux domaines, notamment KS et ACP, mais aussi des domaines de modification du polycétide.

II.C.1. Les PKS de type III

Elles ont été principalement trouvées chez les plantes où elles sont aussi appelées chalcone ou stilbène synthases, et plus récemment chez les bactéries, les champignons et les algues. Leur composition est la plus simple : une cétosynthase-like homodimérique et multi-fonctionnelle (Yu et al., 2018). Elle sélectionne les blocs de construction de type acyl-CoA, les condense itérativement, et assure la cyclisation finale de la chaine ainsi que sa libération (Figure 11 page 18). Pourtant, d’autres enzymes de modification peuvent intervenir par la suite (Weissman, 2009). La longueur finale du polycétide semble être dictée par la taille de la cavité accueillant le substrat au sein de la KS (Jez, Bowman, et Noel, 2001). La diversité des polycétides produits est la conséquence d’une grande variété de blocs de départ et d’extension utilisés, du nombre de condensation, du site de cyclisation intramoléculaire, ainsi que de la nature des nombreuses modifications subséquentes (Palmer et Alper, 2019).

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Figure 11 : Représentation schématique des PKS de type III (tirée de Shen, 2003).

Les PKS de type III synthétisent de nombreuses molécules d’intérêt industriel : chalcones, stilbènes, pyrones, curcuminoïdes, quinolones, résorcinols, et naphthalènes, entre autres. Bien que les PKS de type III soient restées des « boîtes noires » durant de nombreuses années, la résolution récente de structures atomiques de certaines d’entre elles a permis l’avancée de l’ingénierie rationnelle, et des dérivés d’intérêt thérapeutique ont été obtenus. Par exemple, chez la PKS de type III d’Oryza sativa, les résidus responsables de la sélection des blocs acyl-CoA ont été identifiés et mutés, dans le but d’augmenter la promiscuité de substrat de la KS, et de cette manière, deux nouveaux dérivés présentant des activités antibiotiques ont été identifiés (Go et al., 2015).

II.C.2. Les PKS de type II

Ces PKS qui sont responsables de la synthèse de polycétides aromatiques comme les tétracyclines, sont exclusivement procaryotes et majoritairement trouvées chez les

Actinomycètes.

Elles sont composées de petites protéines monofonctionnelles codées par différents gènes, comme vu avec l’exemple du cluster codant l’actinorhodine synthase. Les enzymes interagissent entre elles au cours de la synthèse, ces interactions sont dites « en trans » puisque ce sont des enzymes discrètes et ne sont donc pas dans la même chaine polypeptidique. Ces complexes sont constitués par l’association minimum de trois partenaires qui agissent de manière itérative. Les deux premiers consistent en une KS hétéro-dimérique : la KSα est catalytique, et assure les condensations successives à partir des unités d’extension. Elle interagit avec une KSβ, non catalytique, aussi appelée chain length factor (CLF). Cette KSβest dépourvue de cystéine catalytique et assure le contrôle de la longueur de la chaine polycétidique, soit en orientant les réactions vers un nouveau cycle de polymérisation soit en déclenchant la libération

X n

n

et la cyclisation du polycétide (Keatinge-Clay et al., 2004). De plus, l’hétérodimère KSα/KSβ

serait responsable du contrôle de la régiospécificité de la première réaction de cyclisation au cours de la synthèse du polycétide (Hertweck et al., 2007). Le troisième partenaire est un ACP qui sert comme point d’ancrage de la chaine polycétidique en extension (Figure 12 page 19).

Figure 12 : Représentation schématique des PKS de type II (tirée de Shen, 2003).

Ces domaines ACP subissent une modification post-traductionnelle par l’ajout d’un bras phosphopantéthéine (Ppant) au niveau d’un résidu sérine conservé, cette réaction est catalysée par une enzyme, la phosphopantéthéinyle transférase (PPT). C’est en réalité ce groupement prosthétique qui porte la chaine en élongation et les unités d’extensions tout au long de la catalyse.

Au contraire des PKS de type III, les PKS de type II n’utilisent pas un large panel de blocs de construction. Dans la majorité des cas, la synthèse débute avec une unité acétyl-CoA et les blocs d’extension sont quasiment exclusivement des unités malonyl-CoA. La sélection de ces unités transférées à l’ACP est réalisée par une malonyl-CoA : ACP acyltransférase (MCAT). De manière étonnante, le gène codant cette enzyme est absent dans la plupart des

clusters de PKS de type II. Il est donc proposé que la MCAT intervenant dans la synthèse du

polycétide soit aussi celle intervenant dans la biosynthèse des acides gras ou encore que les domaines ACP soient capables d’auto-malonylation (Hitchman et al., 1998).

D’autres enzymes optionnelles peuvent agir lors de l’élongation de la chaine du polycétide, telles que des cétoréductases (KR) qui catalysent la réduction de la fonction cétone en hydroxyle, des cyclases ou des aromatases (Hertweck et al., 2007). Enfin, le polycétide peut aussi être modifié par des enzymes post-PKS : oxygénases, méthyl- ou glycosyl-transférases, par exemple (Olano, Méndez, et Salas, 2010).

X n

n

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A ce jour, les efforts d’ingénierie de PKS de type II se sont portés sur les différents aspects clés de la synthèse. Par exemple, la longueur de la chaine polycétidique a pu être modifiée grâce à des mutations ponctuelles de la CLF, et des dérivés de l’actinorhodine plus grands de deux unités malonate ont ainsi été obtenus (Tang, Tsai, et Khosla, 2003). Une autre stratégie consiste à modifier le polycétide une fois libéré par la PKS. Par exemple, des nouveaux dérivés de la chélocardine, une molécule appartenant à la famille des tétracyclines et efficace contre de nombreuses bactéries Gram négatives multi-résistantes, ont été générés en introduisant une aminotransférase et une acyltranférase trouvées chez un autre Streptomyces que celui produisant la chélocardine (Lešnik et al., 2015).

II.C.3. Les PKS de type I

Ces PKS sont les plus complexes et les plus variables. Ce sont des multi-enzymes : plusieurs domaines, possédant une structure globulaire propre et se repliant de manière indépendante, sont liés covalemment et chacun porte une activité enzymatique distincte. L’association de trois domaines minimums acyl-transférase (AT), KS et ACP constitue un module et est responsable d’une étape d’élongation de la chaine acylée. Les domaines AT sont responsables de la sélection spécifique des blocs acyl-CoA. Trois domaines optionnels sont responsables de la modification de la fonction β-céto : le domaine KR qui catalyse la réduction de la fonction cétone en hydroxyle, le domaine déshydratase (DH) qui élimine la fonction hydroxyle sous forme d’H2O formant ainsi une double liaison α-β, et enfin le domaine énoyl- réductase (ER) responsable de la réduction de cette double liaison en liaison simple. Ces domaines agissent de manière séquentielle dans l’ordre cité précédemment et leur présence optionnelle assure la diversité de modifications de la fonction cétone (Fischbach et Walsh, 2006). Ainsi, si tous ces domaines optionnels sont présents, un acyl saturé est obtenu lors du cycle d’extension de la chaine. Un domaine thioestérase (TE) assure le clivage de la liaison thioester entre l’ACP et le polycétide final, libérant ainsi ce dernier sous forme linéaire ou plus souvent, cyclique.

Il existe deux grandes familles de PKS de type I, les itératives et les modulaires (non-itératives) comme détaillées ci-dessous.

II.C.3.a. Les PKS de type I itératives

L’extension de la chaine du polycétide se réalise au sein d’un seul et même module utilisé à répétition. Le degré de réduction peut varier pour chaque unité d’extension incorporée

: les domaines KR, DH, et ER, sont donc utilisés de manière optionnelle à chaque cycle d’élongation et les mécanismes de programmation de ces activités sont encore mal compris.

Ces PKS sont trouvées principalement chez les champignons mais également chez les bactéries. Chez les champignons, il est possible de diviser cette famille de PKS en trois catégories selon la présence ou l’absence de domaines réducteurs : non réductrices (nr), partiellement réductrices (pr) et hautement réductrices (hr), comme la lovastatine synthase par exemple (Figure 7 page 12). Nombre d’entre elles possèdent aussi un domaine C-méthyltransférase assurant la méthylation du carbone β du bloc de construction à partir d’S-adénosyl-méthionine (SAM) (Weissman, 2009). Chez les bactéries, ce type de PKS est responsable de la production d’ènediynes, d’acides gras poly-instaurés (PUFA) à longue chaine retrouvés dans les membranes de certaines espèces marines (Metz, 2001), et de petits polycétides aromatiques mono ou bicyclique qui servent de blocs de construction à d’autres métabolites secondaires (Zhang et al., 2013).

Des expériences d’ingénierie rationnelle ont été menées sur les PKS itératives fongiques notamment sur les benzenediol lactone (BDL) synthases (Xu et al., 2014). Les BDL présentent des activités agonistes aux œstrogènes, régulatrices à la réponse heat shock et régulatrices de la réponse immunitaire chez les mammifères, entre autres. Ils sont synthétisés grâce à un tandem de deux PKS, une première hrPKS qui synthétise la partie lipidique qui est ensuite transférée à une nrPKS qui lui greffe un fragment cyclique. La découverte de nombreuses voies de biosynthèse de BDL a permis l’association par ingénierie génétique de hrPKS et nrPKS de voies de synthèse de BDL différents, conduisant à de nouvelles molécules (Xu et al., 2014) (Figure 13 page 21). Ce résultat signifie que les hrPKS et les nrPKS de voies biosynthétiques distinctes peuvent communiquer entre elles de manière efficace.

Figure 13 : Design de l’expérience d'échange de hrPKS et de nrPKS menant à la production de nouveaux produits (tirée de Agarwal et Moore, 2014).

En vert la hrPKS et la nrPKS nécessaires à la synthèse du trans-résorcylide, et en rouge la hrPKS et la nrPKS nécessaires à la synthèse du 10,11-dehydrocurvularine. Différentes combinaisons ont été testées par expression hétérologue et les BDL non naturels obtenus sont présentés en rouge et vert.

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Globalement les PKS de type III, II et I itératives sont difficilement maniables dans le cadre d’expériences d’ingénierie, notamment en raison du mode de synthèse itératif, impliquant un nombre restreint d’enzymes. Tous les aspects clefs de ces synthèses ne sont pas encore maîtrisés, même si les études structurales récentes commencent à donner des éléments de réponse. Ainsi les PKS de type modulaire sont plus attractives pour la biologie synthétique.

II.C.3.b. Les PKS de type I modulaires

Il existe d’autres PKS de type I constituées de plusieurs sous-unités protéiques, elles-mêmes comportant un ou plusieurs modules (Figure 14 page 22). Elles sont donc nommées PKS modulaires ou canoniques.

Figure 14 : Représentation schématique d’une PKS de type I non itératives ou modulaire (fournie par KJ Weissman).

Ces protéines font partie des plus grosses enzymes existantes dans le vivant. Par exemple, la PKS qui produit la mycolactone, facteur de virulence de Mycobacterium ulcerans, est composée de trois chaines peptidiques de très haut poids moléculaire : MLSA1 d’une taille de 1,8 MDa comporte 9 modules, MLSA2 d’une taille de 0,26 MDa, est composée d’un seul module et MLSB qui fait 1,2 MDa comporte 8 modules (Stinear et al., 2004). Deux familles de PKS de type I modulaires d’origines évolutives différentes sont à distinguer, les cis-AT et les

trans-AT.

Introduction

DEBS 1

MODULE 1

MODULE 2

AT ACP ACP ACP KS AT ACP KS AT ACP

KR DH ER DEBS 2 MODULE 3 MODULE 4 DEBS 3 MODULE 5 MODULE 6 KS AT ACP KS AT ACP KR KR TE AT KS KR AT KS 6-Désoxyérythronolide B Erythromycine A Enzymes Post-PKS KR