A. La mFAS comme modèle structural d’un module de PKS modulaire

En raison des fortes homologies de séquences et de mécanismes synthétiques très similaires, les chercheurs se sont longtemps basés sur la structure cristallographique de la mFAS (Figure 26 page 46) (Maier, Leibundgut, et Ban, 2008) pour proposer des modèles d’organisation de modules de PKS de type I comprenant les domaines KR, DH et ER.

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Figure 26 : Représentation cartoon de la structure cristallographique de la mFAS, obtenue à 3,2 Å de résolution et représentation schématique de la protéine (tirée de Maier, Leibundgut, et Ban, 2008).

Les domaines sont représentés par un code couleur, et les linkers séparant les domaines sont indiqués en gris. Les deux portions (condensation et modification) et le linker central séparant ces portions sont indiqués sur la structure, de même que la position du dernier résidu du linker entre la KR et l’ACP. Les domaines KS, DH et ER sont dimériques. En dessous, un schéma de la mFAS indique la position probable des domaines ACP et TE. LD signifie « linker domain » et indique le linker structuré entre le KS et le domaine malonyl/acétyl-transférase (MAT).

Globalement la mFAS adopte une structure dimérique entrecroisée en forme de X, via interactions des domaines KS, DH et ER qui sont homodimériques. Deux chambres réactionnelles sont présentes et elles accueilleraient les domaines ACP et TE, ces deux domaines ne sont pas visibles sur la structure, ceci étant probablement dû à leur trop grande flexibilité. Deux portions peuvent être distinguées : la première assure la condensation avec les domaines KS et malonyl/acétyl-transférase (MAT) et la seconde, la modification des intermédiaires avec les domaines KR, DH et ER (Figure 26 page 46). D’après les distances séparant les différents sites actifs, il est pensé que l’ACP est hautement mobile, passant d’un côté à l’autre de la chambre réactionnelle afin d’atteindre les différents sites actifs ; cela peut

Conden_sation Mo

également expliquer pourquoi ce domaine est absent de la densité électronique. Il est montré par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) que la portion de condensation est capable d’une rotation de 180° par rapport à la portion réductrice (Brignole, Smith, et Asturias, 2009). Ces mouvements sont dus à la présence d’un linker d’une vingtaine de résidus non structurés présent entre les domaines MAT et DH, et rendraient asynchrone la synthèse dans les deux chambres. L’élongation a lieu dans la chambre réactionnelle relativement close, alors que la réduction a lieu dans celle qui est plus ouverte. De plus, la distribution des conformations pourrait être influencée par la présence du substrat ou par l’inactivation de certains domaines catalytiques, ce qui suggère une corrélation directe entre la configuration du module et l’étape de biosynthèse.

D’autres domaines non actifs se situent aussi dans la portion réductrice de la mFAS. Le premier est un domaine pseudo cétoréductase (ΨKR), analogue au domaine KR mais dont le

Rossmann fold est tronqué, et qui assure une pseudo-homodimérisation. Le second est un

domaine pseudo-méthyltranférase (ΨMT), dont le site de fixation au cofacteur SAM est muté, rendant sa prise en charge impossible.

Quant aux PKS, des études préliminaires de protéolyse ménagée couplée au

cross-linking réalisées sur des sous-unités de DEBS, ont permis d’émettre l’hypothèse de modules et

de sous-unités homodimériques (Staunton et al., 1996). Par la suite des structures cristallographiques et RMN de tous les domaines d’un module ont été obtenues, soit sous la forme de domaines isolés, soit sous la forme de didomaines (Weissman, 2017) (Figure 27 page 48).

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Figure 27 : Structures haute résolution de domaines individuels et de didomaines de PKS modulaires (tirée de Weissman, 2017).

Sont présentés : la structure cristallographique du didomaine KS5-AT5 de DEBS (orange : domaine de docking N-terminal, bleu : KS, vert : AT, jaune : linker de la KS vers l’AT, rouge : linker post-AT ; la structure RMN de l’ACP2 de DEBS, la sérine phosphopanthéthéinylée est présentée en sphères ; la structure cristallographique de la DH4 de DEBS, l’histidine catalytique est présentée en sphères ; la structure cristallographique de la KR2 de l’amphotéricine synthase, de type A1, les domaines catalytiques et structuraux sont indiqués, la Tyr catalytique et le cofacteur NADP+ sont présentés en sphère ; la structure cristallographique du domaine ER monomérique de la spinosyne synthase, le cofacteur NADP+ est présenté en sphères ; la structure cristallographique du domaine TE homodimérique de DEBS.

Ces structures permettent de proposer une organisation homodimérique des PKS cis-AT, puisque les domaines KS, DH et TE sont homodimériques. De manière globale, ces domaines isolés présentent des structures très similaires à leur équivalent chez la mFAS (Keatinge-Clay et Stroud, 2006 ; Tang et al., 2006 ; Tang et al., 2007 ; Alekseyev et al., 2007). Par exemple, la disposition du didomaine KS-AT est identique entre les deux systèmes, la position de chaque domaine étant fixée par rapport à l’autre grâce à la présence d’un linker

structuré reliant la KS à l’AT. Sur cette base, plusieurs modèles d’organisation structurale des modules de PKS ont été proposés (Figure 28 page 49).

Figure 28 : Proposition de structuration d’une construction multi-modulaire de PKS (tirée de Zheng et al., 2012).

Ce modèle est proposé pour les modules de la mycolactone synthase, incluant des domaines KR et DH (module 3) ou tous les domaines de modification (module 2).

Cependant des divergences notables émergent au cours de ces études : en effet chez les PKS modulaires, les domaines ER sont monomériques et les domaines TE homodimériques (Zheng et al., 2012 ; Tsai et al., 2001), l’interface entre les domaines ER et DH sont très différentes, et les domaines DH ne s’homodimérisent pas de la même manière (Keatinge-Clay, 2008). Ces différences non négligeables ont posé alors la question de la validité du modèle de la structuration modulaire des PKS basée sur la mFAS.