Erythromycine A 6-Désoxyérythronolide B
Enzymes post-PKS
exemple de la PKS modulaire synthétisant l’érythromycine A
Cortes et al., Nature (1990), 348 : 176-8
Introduction
DEBS 1
MODULE 1
MODULE 2
AT ACP ACP ACP KS AT ACP KS AT ACP
KR DH ER DEBS 2 MODULE 3 MODULE 4 DEBS 3 MODULE 5 MODULE 6 KS AT ACP KS AT ACP KR KR TE AT KS KR AT KS 6-Désoxyérythronolide B Erythromycine A Enzymes Post-PKS KR
PKS synthétisant l’érythromycine A
IntroductionCortés, et al. (1990) Nature 346, 176–178
CHARGEMENT
FIN
Biologie synthétique des PKS modulaires
Erythromycine A 6-Désoxyérythronolide B
Enzymes post-PKS
exemple de la PKS modulaire synthétisant l’érythromycine A
Cortes et al., Nature (1990), 348 : 176-8
II.C.3.b.i. Les PKS cis-AT
Chez ces enzymes, tous les domaines qui composent les modules sont présents au sein de la même sous-unité, c’est-à-dire de la même chaine polypeptidique, que ce soient les domaines minimaux (AT, ACP et KS), les domaines optionnels (KR, DH et ER) ou encore le domaine de terminaison (TE).
La première PKS de ce genre mise en évidence est DEBS (évoquée en II.B.). Elle est responsable de la synthèse du cœur macrolactone de l’érythromycine (appelé
6-deoxyerythronolide B (6-dEB)) chez Saccharopolyspora erythraea (Cortes et al., 1990). Cette
PKS est certainement la plus étudiée de toutes depuis la fin des années 1980, et sert donc largement de modèle quant au fonctionnement de ces enzymes (Figure 15 page 23).
Figure 15 : Représentation schématique de la PKS synthétisant l’érythromycine A (fournie par KJ Weissman).
La PKS DEBS est composée de trois sous-unités protéiques : DEBS 1, DEBS 2 et DEBS 3, toutes composées de 2 ou 3 modules.
La synthèse débute par le recrutement d’un propionyl-CoA par le domaine AT du module de chargement qui le transfère alors sur l’ACP voisin. Cet ACP du module de chargement transfère alors l’unité propionyl à la KS du module 1 au niveau de sa cystéine catalytique. De la même manière, l’AT du module 1 sélectionne un méthylmalonyl-CoA comme unité d’extension et le transfère sur l’ACP du module 1. Cet ACP présente l’unité d’extension à la KS, déjà modifiée
Introduction
DEBS 1
MODULE 1
MODULE 2
AT ACP ACP ACP KS AT ACP KS AT ACP KR DH ER DEBS 2 MODULE 3 MODULE 4 DEBS 3 MODULE 5 MODULE 6 KS AT ACP KS AT ACP KR KR TE AT KS KR AT KS 6-Désoxyérythronolide B Erythromycine A Enzymes Post-PKS KR
PKS synthétisant l’érythromycine A
IntroductionCortés, et al. (1990) Nature 346, 176–178 CHARGEMENT
FIN
Biologie synthétique des PKS modulaires
Erythromycine A 6-Désoxyérythronolide B Enzymes
post-PKS
exemple de la PKS modulaire synthétisant l’érythromycine A
24
par l’unité de départ, et la KS1 catalyse la réaction de condensation et forme ainsi un dicétide. L’ACP, chargé du dicétide, peut alors le présenter au domaine KR1 qui catalyse la réaction de réduction de la fonction cétone en hydroxyle au niveau du carbone β. Le dicétide réduit est ensuite transféré à la KS2 par l’ACP et un nouveau cycle d’extension et de modification peut avoir lieu au sein du module 2. Il y a ainsi six cycles d’extension de la chaine, un par module, et de modifications chimiques, et en fin de synthèse, le domaine TE présent en C-terminale (Cter) du module 6 catalyse la libération du polycétide et sa cyclisation et forme le 6-dEB. Cet intermédiaire est ensuite maturé par cinq enzymes post-PKS qui vont, entre autres, ajouter deux unités glycosidiques et former l’érythromycine A, la molécule antibiotique.
Au sein d’un même module, les différents domaines fonctionnels sont séparés par des séquences de liaison appelées linkers. Ces séquences peuvent être non structurées et très flexibles, riches en alanines, prolines et résidus chargés ou bien présenter une structure tertiaire et jouer un rôle structural important. C’est notamment le cas du linker entre les domaines KS et AT qui sert d’adaptateur structural entre ces domaines (Whicher et al., 2014).
Chez ce type de PKS, il existe une relation directe entre la séquence ADN, la séquence primaire de la PKS et donc la composition en domaine des modules, et la nature du composé synthétisé. Chaque module agit dans l’ordre selon lequel il est situé au sein de la séquence polypeptidique, et par conséquent, l’enchainement en domaines des modules dicte la structure du polycétide synthétisé. Cette relation est décrite sous le terme de règle de la colinéarité (Minowa, Araki, et Kanehisa, 2007) et est propre aux PKS de type cis-AT. Ceci a été démontré pour la première fois par des expériences d’inactivation d’une KR (Donadio et al., 1991) ou d’une ER (Donadio et al., 1993) dans les modules 5 et 4 respectivement de DEBS. Ces expériences ont mené à la formation des dérivés polycétidiques avec absence des modifications aux positions attendues. Dans ce cas, la modification d’un domaine ou d’un module entraîne un changement direct et prévisible de la structure du polycétide à la position voulue, d’où l’engouement que l’étude de ces enzymes suscite en vue d’approches d’ingénierie génétique.
II.C.3.b.ii. Les PKS trans-AT
Chez ces enzymes, certains domaines d’un même module et notamment les AT, sont absents (Piel, 2010). Les ACP sont acylés par l’intermédiaire de domaines AT discrets, situés en dehors de la PKS, et qui interagissent en trans. La bacillaene synthase est la première PKS
Malheureusement, aucune trace du polycétide n’a été détectée, ce qui aurait permis de prouver que cette enzyme était bien fonctionnelle, et le séquençage comportait de nombreuses erreurs. Il a fallu attendre 2002 pour que la première PKS trans-AT rattachée à la production d’un polycétide soit mise en évidence chez une bactérie symbiotique de Paederus fuscipes, une espèce de scarabée (Piel, 2002). Cette PKS responsable de la synthèse de pédérine, un anti-cancéreux, ne dispose pas d’AT au sein de la séquence des modules et il a été supposé que c’est une AT discrète, dont le gène est présent au sein du cluster, qui acyle les ACP. Ce type d’acylation a été confirmée in vitro par la suite chez la PKS responsable de la synthèse de leinamycine (Cheng, Tang, et Shen, 2003).
Bien que les cis-AT et les trans-AT soient similaires en termes de composition en domaines, ces dernières présentent de nombreuses particularités. Alors que les cis-AT ne présentent qu’un nombre limité de combinaisons de domaines (selon la présence ou non des domaines réducteurs), une panoplie très étendue de modules est rencontrée chez les trans-AT. A ce jour, il en a été découvert plus de 50 distincts (Piel, 2010) et il y a plusieurs raisons pour expliquer cela. D’abord il est possible de rencontrer des modules de NRPS permettant l’incorporation d’acides aminés dans la chaine polyétidique en croissance au lieu d’unités acyles.
Les NRPS produisent aussi des composés à fort intérêt thérapeutique. Elles présentent une logique synthétique similaire à celle des PKS modulaires. En effet, elles sont aussi composées de plusieurs modules catalysant chacun l’incorporation d’un acide aminé au sein du peptide en extension. Trois domaines différents caractérisent un module minimal. Le domaine d’adénylation (A), comparable au domaine AT, sélectionne spécifiquement un acide aminé (il existe un domaine A différent pour chaque acide aminé) et l’active par adénylation au niveau du groupement carbonyle (Figure 16 page 26). Ce bloc de construction adénylé est ensuite transféré à l’analogue du domaine ACP : le peptidyl carrier protein (PCP), qui sert aussi de support à la chaine en croissance via l’intermédiaire d’un groupement phosphopantéthéine. Enfin un domaine de condensation (C), « équivalent » du domaine KS, catalyse la réaction de condensation entre les acides aminés liés aux domaines PCP en formant une liaison peptidique.
26
Figure 16 : Représentation schématique de la logique synthétique des NRPS (adpatée de Weissman, 2015). Le domaine actif est indiqué par des contours ondulés. La biosynthèse débute par i) l’adénylation, réalisée par le domaine A, d’un acide aminé spécifique en présence d’ATP et de Mg2+, et ensuite ii) cet acide aminé activé est transféré au domaine PCP du même module servant de support. Le domaine C catalyse la formation de la liaison peptidique en utilisant les deux aminoacyles liés aux PCP comme substrat. Cette séquence de réactions est répétée jusqu’à ce que le peptide final soit libéré par le domaine TE terminal.
Le peptide en croissance peut être modifié par des N-méthyltransférase, des épimérases, permettant la présence d’acides aminés de la série D, et il peut aussi subir des hétérocyclisations grâce à des domaines hétérocyclases (HC), des oxydations et des réductions, entre autres modifications (Walsh et al., 2001). La présence de modules NRPS au sein des PKS trans-AT assure ainsi l’incorporation d’acides aminés au sein du polycétide, et ces hybrides PKS-NRPS permettent la génération de produits d’une grande variété structurale.
Une autre raison au nombre varié de modules différents rencontrés chez les trans-AT réside dans la présence non négligeable au sein de ces derniers de domaines de C-méthylation (MT) modifiant le carbone α de l’intermédiaire à partir de SAM. Il n’est pas rare non plus que des modules soient scindés sur deux chaines polypeptidiques différentes ou qu’ils comprennent des domaines catalytiques disposés dans un ordre inhabituel voire des domaines inactifs. Enfin en cours de synthèse, d’autres enzymes discrètes de modification peuvent agir en trans pour assurer des méthylations sur la position β du polycétide en croissance. Un exemple de PKS
trans-AT est celui de la virginiamycine M synthase de S. virginiae (Figure 17 page 27) dont le
fonctionnement sera développé en V.A.
NATURE CHEMICAL BIOLOGY| VOL 11 | SEPTEMBER 2015 | www.nature.com/naturechemicalbiology 661