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favorisant des interactions « latérales » et stabilisant ainsi les interactions « verticales » (Figure 43 page 71).
Figure 43 : Modèle proposé de formation du mega complexe de PKS trans-AT stabilisé par des interactions verticales entre sous-unités et latérales entre KS d’un même module (tirée de Gay et al., 2016).
Cependant les auteurs de cette étude n’ont confirmé ces résultats par aucune méthode plus adaptée pour déterminer l’état oligomérique de ces domaines. De plus, aucun autre domaine ou didomaine n’a été étudié, or les travaux de cryo-EM portant sur un module entier ont démontré que les structures isolées des didomaines KS-AT n’adoptent pas la même conformation lorsqu'ils sont replacés dans leur contexte modulaire. Il se peut donc que la
containing KS does not display the LINKS interaction (MgsKS7). Favorable crystal contacts made elsewhere may preclude this interaction in the same manner that LINKS-mediated crystal con-tacts within the monomeric crystal structure of PksKS2 are favored over natural homodimer interactions.
The prevalence of the LINKS motif within manytrans-AT sys-tems suggests that megacomplex formation may be a more com-mon occurrence than is currently recognized. The mode through which LINKS interactions could stabilizetrans-AT PKS megacom-plexes has not been observed in the architectures of other biosyn-thetic assemblies. The crystal structures presented here reveal a defined binding interface formed by hydrophobic and ionic inter-actions mediated by three helices on the surface of the flanking
interactions between the assembly lines of the megacomplex through avidity. While trans-AT systems represent an excellent template for the rational engineering of synthetic PKSs for the exploration of new medicines, it may be necessary to consider the implications of modifying the LINKS network when genetically relocating modules or domains within a trans-AT PKS megasynthase.
4. Methods
All constructs described in this work were cloned and purified using identical methods to those previously described for PksKS2 Fig. 5.Vertical and lateral interactions stabilize the PKS megacomplex. The electron micrographs observed by Straight et al. revealed a dense mass associated with the membrane ofB. subtiliscells, identified to consist of numerous copies of the PksX megasynthase (Straight et al., 2007). An image from that work is reprinted here, revealing that the observed superstructure measures approximately 150!150 nm. The arrow points to the cell membrane, and the arrowhead points to gold nanoparticles that bind PksR. For visualizing how this mass of proteins may self-associate, a diagram shows the assembly line subunits (PksJ, PksL, PksM, PksN, and PksR) interacting vertically through domain–domain interactions, and laterally through the LINKS network. The estimations for megacomplex dimensions that flank the cartoon are calculated based on available crystal structures of individual PKS domains. In the vertical dimension, 175 nm is represented by 15 PKS modules and 2.5 NRPS modules (10 nm each). In the lateral dimension, 160 nm is estimated by the total length of 15 KS homodimers that polymerize through LINKS interactions.
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structuration de ces motifs LINKS ne soit pas représentative de la structuration native de cette région au sein du module.
V.Présentation de nos systèmes d’études
V.A. La virginiamycine synthase, une PKS trans-AT
La virginiamycine M est une molécule présentant une activité bactériostatique et produite par Streptomyces virginiae. Cette souche présente la particularité de produire une autre molécule bactériostatique, la virginamycine S. Un effet synergique est observé lors d’une utilisation combinée des molécules. D’ailleurs une combinaison des dérivés hémi-synthétiques de la virginiamycine M et de virginamycine S, la dalfopristine et la quinupristine respectivement, commercialisée sous le nom de Synercid®, est utilisée pour traiter des infections par des bactéries Gram-positifs résistantes à la vancomycine (Niccolai, Tarsi, et Thomas, 1997). Leur activité est alors accrue d’un facteur cent (Cocito, 1979).
La virginiamycine M est un inhibiteur de la synthèse protéique. Plus particulièrement, elle se fixe à la grande sous-unité 50s des ribosomes procaryotes, à cheval sur les sites P et A, empêchant alors la fixation de l’ARNt au niveau du site P (Hansen, Moore, et Steitz, 2003). En se fixant, un changement conformationnel de la sous-unité ribosomique est induit (Parfait et Cocito, 1980), ce qui permettrait à la virginiamycine S de se fixer, d’où l’effet synergique observé entre les deux molécules. Cette dernière se fixe également au niveau des sites A et P du ribosome mais en empêchant cette fois-ci la formation de la liaison peptidique. Alors que la virginiamycine S est synthétisée par une NRPS (Namwat et al., 2002), la virginiamycine M est quant à elle synthétisée par un hybride PKS/NRPS (Pulsawat, Kitani, et Nihira, 2007).
Le cluster de gènes de la virginiamycine M synthase comporte entre autres, trois gènes codant pour trois sous-unités de PKS (Figure 44 page 73).
Figure 44 : Voie de synthèse proposée de la virginamycine M (adaptée de Dorival et al., 2016).
La PKS complète comporte sept modules PKS et deux modules NRPS (modules 3 et 8). Le module de chargement et le module 10 sont manquants dans le séquençage de la PKS (Pulsawat, Kitani, et Nihira, 2007). Au niveau du module 5, une méthylation sur la position best introduite par VirB−E et un ACP (VirAB). La position de cette méthylation est indiquée par un cercle en pointillés. VirI est l’AT discrète et VirJ présente l’activité TE. Le dernier module responsable de l’incorporation de la proline est manquant dans le séquençage de la PKS, et n’est donc toujours pas identifié. Le module 9 présente une KS ne possédant pas d’histidine catalytique, nommée KSo.
VirA est composée de cinq modules, tandis que VirFG et VirH sont composées de deux modules chacune. Le gène du module de chargement ainsi que celui du module 10, responsable de l’incorporation de la proline terminale, ne sont pas identifiés dans la séquence génomique de S. virginiae disponible dans les bases de données. Ils ont cependant mis en évidence dans un
cluster homologue chez S. pristinaspiraelis qui synthétise la même molécule (Mast et al.,
2011). Le cluster ne comporte qu’un seul gène codant pour un domaine AT : VirI, responsable de la sélection spécifique du malonyl-CoA. Deux modules NRPS sont présents au sein des sous-unités : le module 3 qui incorpore une glycine et le module 8 une sérine. Les modules 1 et 5 sont caractéristiques des PKS trans-AT et comportent deux domaines ACP en tandem.
Deux hypothèses sont émises quant au rôle d’un tel tandem. La première est que ces ACP peuvent travailler en parallèle et ainsi augmenter la production du polycétide (Rahman et
in myxo- and cyanobacteria, has been designated as Class 2.17 (By extension, the mixed PKS-NRPS DDs constitute Class 3.) Class 1 and 2 DDs share two central features: the N-terminal docking domains are homodimeric and form a coiled-coil motif that serves as a platform for docking of the likewiseα-helical C-terminal docking domains. The docking interfaces are largely hydrophobic in character and complementary in shape, whereas specific charge−charge interactions at critical positions contribute to docking specificity. One notable difference between the two classes is that Class 1 C-terminal docking domains (Figure 2A,B) incorporate twoαhelices upstream of the dockingαhelix which together form a dimerization motif. Class 2 C-terminal docking domains, however, comprise only two α helices, both of which associate with the N-terminal docking domain. Furthermore, the coiled-coil motif of the Class 2 N-terminal DD is preceded by an additional αhelix; thus, docking gives rise to an overall eightα-helical bundle (Figure 2C), in contrast to the fourα-helical bundles characteristic of Class 1 DDs. Despite this architectural divergence and an approximately 2-fold difference in interface size, the affinity of association for both DD classes when the immediate upstream/
downstream functional domains are present is remarkably consistent, withKds in the 2−20μM range.16,17,20
We recently characterized by small-angle X-ray scattering (SAXS)21the structure ofapomodule 5 from the VirA subunit of the virginiamycin hybrid trans-AT PKS-NRPS4 of Streptomyces virginiae (Figure 1). In the course of this work, we noted that the extreme C-terminal sequence (designated “VirA CDD”) showed similarity to a region from the CurA subunit of the curacincis-AT PKS, which had been described as a dimerization motif.22However, comparison by SAXS ofapo module 5 in the presence and absence of this region did not reveal a change in the structure of the C-terminus because the module retained its open form. This prompted us to investigate whether VirACDD was rather a docking domain, mediating a specific interaction with a partner DD located at the N-terminus of subunit VirFG (“VirFGNDD”). We show here that VirACDD and VirFGNDD constitute the founding members of a new family of docking domains fromtrans-AT PKSs. Using a multidisciplinary approach combining NMR, site-directed mutagenesis, circular dichroism (CD), isothermal titration calorimetry (ITC), and SAXS, we have characterized their interaction in detail. We have furthermore employed SAXS to
Figure 1.Virginiamycin (Vir)trans-AT polyketide synthase. The PKS comprises three subunits, VirA, VirFG (whose N-terminal sequence was recently revised by us),21and VirH as well as additional modules that were not identified in the initial cluster description4for starter unit selection and introduction of proline. The ? indicate additional steps where the enzyme responsible is not yet clear. The system incorporates many features characteristic oftrans-AT PKS systems, including atrans-acting acyl transferase VirI, duplicated domains (acyl carrier proteins (ACPs) of modules 1 and 5; peptidyl carrier proteins (PCPs) of module 8), nonribosomal peptide synthetase modules (3 and 8), an inactive domain (KS°of module 9), and a cassette of enzymes that together introduce aβ-methyl functionality. The experiments described here reveal the molecular details of the interface between subunits VirA and VirFG (boxed).
DOI:10.1021/jacs.5b13372
J. Am. Chem. Soc.2016, 138, 4155−4167
4156
VirA VirFG VirH
Cassette de β-méthylation
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d’augmenter le temps de présence de l’intermédiaire réactionnel au sein du module et favoriserait donc des modifications supplémentaires avant qu’il ne soit transféré au module suivant (Calderone et al., 2008). D’ailleurs, une cassette de b-méthylation, composée de cinq protéines (VirAB, VirB-E)(Davison et al., 2014), intervient au niveau du tandem d’ACP (ACP5a et ACP5b) du module 5 et assure la méthylation du carbone b du polycétide en cours de croissance. Il est supposé que le domaine TE du module manquant assure la libération et la cyclisation de la molécule en fin de synthèse. Enfin une déshydrogénase, proposée être VirM, oxyde la proline permettant l’obtention de la molécule finale active.
A mon arrivée au laboratoire, aucune information n’était disponible quant au mécanisme d’interaction entre sous-unités de PKS trans-AT. La première interface étudiée au cours de ma thèse se situe donc entre les sous-unités VirA et VirFG, et plus précisément entre le module 5, qui présente le tandem d’ACP, et le module 6 qui présente une composition plus habituelle : une KS, une KR et un ACP.
V.B. L’enacyloxine synthase, une PKS hybride cis-/trans-AT
Un autre objectif de ma thèse consistait à caractériser des DD entre chaque interface de l’enacyloxine synthase évoquée en II.C.3.b.ii. A ce jour, aucune étude exhaustive n’est menée sur tous les DD d’un même système PKS. Ceci permettrait de mieux comprendre les déterminants clés responsables de la spécificité d’interaction entre sous-unités, et ainsi mieux appréhender et maîtriser la construction de systèmes chimériques.
L’enacyloxine est synthétisée par Burkholderia ambifaria, une bactérie Gram-négative appartenant au Burkholderia cepacia complex (Bcc), un sous-groupe d’espèces de Burkholderia très proches et connu pour leur production de métabolites secondaires à forts intérêts, présentant des activités antibactériennes et antifongiques (Parke et Gurian-Sherman, 2001 ; Vial et al., 2008 ; Seyedsayamdost et al., 2010). Cette molécule présente une activité antibiotique face à des souches pathogènes multi-résistantes telles que P. aeruginosa et Acinetobacter baumanii (Mahenthiralingam et al., 2011). Pour l’Organisation Mondiale de la Santé, ces deux souches sont récemment passées dans la catégorie de priorité la plus élevée de pathogènes multi-résistants pour lesquels il existe un besoin critique de recherche et de développement de nouveaux antibiotiques (Tacconelli et Magrini, 2017). Il serait donc intéressant de modifier la structure cœur de la molécule qui n’est pas stable due à l’isomérisation de doubles liaisons
(Figure 45 page76). Afin de faciliter les échanges de modules voire de sous-unités de ce système, nous nous sommes intéressés à toutes les interfaces entre sous-unités PKS de ce système.
L’enacyloxine synthase (Figure 45 page76) en présente six puisqu’elle est composée de sept sous-unités (5925−5919), ce qui est relativement élevé par rapport à d’autres systèmes (Helfrich et Piel, 2016 ; Medema et al., 2015). Sur ces six interfaces, cinq d’entre elles impliquent un ACP et une KS. Cette PKS est donc un excellent modèle pour mieux comprendre comment la spécificité d’interaction est médiée dans une telle configuration. De plus, l’une des interfaces, celle située entre les sous-unités 5924 et 5923, consiste en un module « splité » : la KS du module 3 est localisée à l’extrémité Cter de la sous-unité 5924, alors que les domaines KR et ACP de ce même module 3 sont portés par la sous-unité suivante.
Comme évoqué précédemment, des analyses bio-informatiques démontrent que, de manière surprenante, les six premières sous-unités (5925−5920) appartiennent à la classe des PKS cis-AT et seule la dernière sous-unité (5919) appartient à la classe des PKS trans-AT. Chaque sous-unité comporte un à deux modules, mais tous les modules ne présentent pas systématiquement de domaine AT, même ceux appartenant à la classe des PKS cis-AT. Seuls les modules 1 et 6 en présentent un. Cependant aucun gène du cluster ne code pour un tel domaine ; il a donc été proposé que le domaine AT du module 1 ou 6 charge en trans les ACP des autres modules avec le malonyl-CoA, ou que la réaction peut être catalysée par une protéine codée par un gène situé en dehors du cluster de la PKS. En effet, quatre gènes ont été identifiés dans le génome de B. ambifaria qui codent pour des domaines AT et présentent une forte homologie avec les AT présents dans les sous-unités 5925 et 5921 (Mahenthiralingam et al., 2011).
tro d u ctio n 76 MT GNAT KS AT DH KR ACP ACP 5925 LOAD MODULE 1 KS KR ACP MODULE 2 MODULE 3 (split) 5924 KR ACP KS KR ACP 5923 MODULE 4 KS DH KR MODULE 5 ACP MT 5922 KS AT KR ACP KS DH KR ACP MODULE 7 MODULE 6 5921 KS DH KR MODULE 8 ACP MT KS DH ACP MODULE 9 5920 KS DH KR ACP MODULE 10 5919 KS° PCP KS C 5912 5913 5914/5918 5916 Shikimate 5927 FADH2 5928 O2 5921 a-ketoglutarate 5930 Decarbamoyl-enacyloxin IVa (D-4,5 = E)
iso-Decarbamoyl-enacyloxin Iva (D-4,5 = Z) Enacyloxin IVa (D-4,5 = E)
iso-Enacyloxin Iva (D-4,5 = Z) 5932
Enacyloxin IIa (D-4,5 = E)
iso-Enacyloxin IIa (D-4,5 = Z)
PQQ
PKS/NRPS STAGE
POST ASSEMBLY LINE STAGE
5917 5915
Figure 45 : Organisation en domaines et modules de la PKS synthétisant l'enacyloxine (adaptée de KJ Weissman).
Le mécanisme de condensation de la chaine polycétidique avec l'acide dihydroxycyclohexane carboxylique (DHCCA) et les modifications post-PKS sont présentés. L'ordre des réactions de modification du polycétide n'est que supposé et ces réactions pourraient aussi avoir lieu durant la synthèse de la molécule par la PKS.
Il existe également quelques différences entre la structure déterminée de l’enacyloxine IIa et la structure prédite de l’intermédiaire porté par l’ACP du module 9. Le module 9 est composé d’une KS, d’une DH et d’un ACP, ce qui est étonnant puisque la molécule finale présente bien une double liaison entre les carbones 4 et 5 alors qu’aucun domaine KR n’est présent au sein du module pour réduire la fonction céto en hydroxyle. Les auteurs proposent que cette réduction et l’élimination de l’eau sont catalysées par les domaines KR et DH du module 10. Il est également proposé que la double liaison entre les carbones 10 et 11 est introduite par le domaine DH du module 7, puisque le module 6 n’en comporte pas. La présence des groupements chlore sur les carbones 11 et 18, ainsi que le groupement hydroxyle du C14 et le carbamoyl du C19 seraient, quant à eux, introduits par des enzymes post-PKS présentent dans le cluster de gènes de la PKS (Figure 45 page76).
Des travaux récents (Kosol et al., 2019 ; Masschelein et al., 2019) ont mis en lumière le mécanisme inhabituel de libération de la chaine polycétidique par la PKS. Le dernier module, de nature trans-AT, présente à son extrémité Cter un domaine KS0, inactif, assurant la trans-acylation de l’intermédiaire vers un domaine PCP (5917). Par la suite, l’intermédiaire est présenté à la protéine 5915 dont la séquence est similaire à un domaine de condensation de NRPS. Ce domaine catalyse une réaction inhabituelle d’estérification de l’intermédiaire avec l’acide dihydroxycyclohexane carboxylique (DHCCA) et la libération concomitante de la molécule. C’est la première fois qu’un tel mécanisme de libération a été mis en évidence (Masschelein et al., 2019). La résolution de la structure cristallographique du domaine de condensation a mis en évidence à son extrémité Nter un DD de type 3 monomérique, adoptant le fold abbaa (Kosol et al., 2019). De manière attendue, la structure RMN du domaine PCP présente une extrémité Cter extrêmement flexible qui entre en interaction avec le NDD du domaine C, probablement via le même mécanisme d’insertion et de formation d’un brin b déjà mis en évidence (Hacker et al., 2018). Il semble aussi que les deux domaines, PCP et C, subissent des changements de conformation importants lors de l’interaction, ce qui jouerait un rôle lors de la catalyse réalisée par le domaine C.
V.C. LkcE, une enzyme post-PKS
La lankacidine est un antibiotique couramment utilisé en médecine vétérinaire pour traiter le bétail infecté par des bactéries Gram-positifs pathogènes (Hayashi et al., 1988). Elle est commercialisée sous le terme de sédécamycine ou terdécamycine, pour son variant hémi-synthétique.
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Tout comme la virginiamycine M, la lankacidine agit en synergie avec un autre polycétide, la lankamycine. La production des deux antibiotiques est d’ailleurs co-régulée et co-induite par la présence de γ-butyrolactone, suggérant que les deux polycétide ont co-évolué pour agir simultanément (Arakawa et al., 2007 ; Yamamoto et al., 2008). Ces deux molécules se fixent sur la sous-unité 50S du ribosome. La structure cristallographique du complexe a été résolue avec les deux molécules, permettant d’identifier le site de fixation de chaque antibiotique (Auerbach et al., 2010 ; Belousoff et al., 2011). La lankamycine se fixe au niveau du centre peptidyl-transférase alors que la lankacidine se lie au niveau du site accepteur, empêchant ainsi le positionnement adéquat de l’acide aminé porté par l’ARNt. La fixation de la lankacidine n’altère en rien la fixation de la lankamycine, ce qui explique l’effet synergique.
Les deux systèmes PKS sont codés chez S. rochei (Kinashi et al., 1994) par un plasmide portant également les gènes de régulation : le plasmide PSLA2-L. Ce plasmide de 200 kb a été séquencé par la suite, révélant la présence de quatre clusters de gènes responsables de la synthèse de quatre métabolites secondaires (Suwa et al., 2000).
La lankacidine synthase est une PKS trans-AT qui assure la condensation de huit unités malonate et d’une glycine. Cependant, seules cinq KS sont présentes au sein du cluster, ce qui suggère que plusieurs modules agissent de façon itérative. Plusieurs voies de synthèse sont proposées pour la lankacidine (Piel, 2010). La plus probable (Figure 46 page 79) impliquerait la protéine LkcA, qui comporte le module de chargement NRPS ainsi qu’un domaine KS, et qui catalyserait l’incorporation de la glycine en tant qu’unité de départ (Dickschat et al., 2011). Ensuite, huit unités malonates supplémentaires sont ajoutées. Pour cela, LkcC et LkcF agiraient tour à tour pour catalyser respectivement trois et deux cycles d’extension. Enfin, la protéine LkcG catalyserait le dernier cycle d’extension et la libération du polycétide. Il est à noter qu’une DH discrète, la LkcB interviendrait lors de plusieurs cycles d’extension (Dickschat et al., 2011 ; Tatsuno, Arakawa, et Kinashi, 2007 ; Tatsuno, Arakawa, et Kinashi, 2009).
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Figure 46 : Schéma de la voie de synthèse proposée pour la lankacidine C (fournie par KJ Weissman).
La libération de la chaine par le domaine TE de LkcG n’entraine pas la cyclisation complète du polycétide. L’intervention d’une enzyme post-PKS est donc nécessaire pour catalyser la macrocyclisation du composé libéré. Ainsi, la LkcE, une flavoenzyme appartenant à la famille des amine oxydases, catalyse l’oxydation de l’intermédiaire amide non-cyclique en