Dans ce chapitre nous étudions une technique de microscopie de fluorescence à éclairement structuré, restreinte à l’imagerie de surface, mais présentant théoriquement une résolution bien meilleure que la limite de diffraction. L’idée principale consiste à remplacer les lamelles de verre sur lesquelles sont déposées les échantillons par des substrats périodiquement structurés [155,156], afin de créer des grilles de lumière dont la période est bien inférieure à λ/2. Il est alors possible d’améliorer de manière significative la limite de résolution latérale de l’éclairement structuré, sans utiliser un régime non-linéaire de fluorescence (comme proposé dans [91,92]).
Dans une première partie, nous détaillons la conception théorique de ces structures diélectriques. Celles-ci sont considérées comme la combinaison d’un guide d’onde plan et d’un réseau de couplage, formant un résonateur optique dont les modes propres peuvent être exploités pour former une grille de lumière évanescente comportant de très hautes fréquences spatiales, inaccessibles dans une configuration classique (> 2𝑘0𝑁𝑁 ).
Nous montrons ensuite les différentes étapes de la fabrication de ces composants nanostructurés qui ont été fabriqués au Laboratoire de Photonique et Nanostructures de Marcoussis.
Enfin, nous présentons la caractérisation expérimentale du comportement optique de ces réseaux. Pour cela, des mesures en champ proche optique ont été réalisées en collaboration avec le groupe d'optique de champ proche du Laboratoire Interdisciplinaire Carnot de Bourgogne. Des observations en champ lointain (par fluorescence) ont également été menées. Celles-ci tirent parti d’une structuration basse fréquence de la grille de lumière, résultant d’un effet de Moiré entre un mode résonnant à haute fréquence latérale et un mode non résonant de fréquence un peu moins élevée.
Introduction
Dans les chapitre I et III, nous avons montré que l’éclairement structuré en fluorescence permettait d’obtenir des images en champ large, d’une résolution près de deux fois supérieure à celle d’une image obtenue avec un champ homogène. Cette technique est aujourd’hui relativement mature, et proposée dans des microscopes commerciaux (Nikon N-SIM et Zeiss ELYRA (P)S.1). Si l’on reste dans un régime linéaire de fluorescence, l’amélioration de la résolution est limitée par la période de la grille de lumière ou, plus généralement, par les fréquences qu’elle contient. La plus petite période que l’on peut obtenir est donnée par la figure d’interférence de deux faisceaux laser collimatés : elle vaut
𝑝 = 2𝑛𝑠𝑖𝑛(𝜃),𝜆0
où n désigne l’indice de réfraction du milieu dans lequel se propagent les deux faisceaux et 𝜃
l’angle formé entre leurs directions de propagation respectives et la normale au plan dans lequel on mesure la période. On comprend avec cette
formule qu’il est intéressant d’augmenter l’angle d’incidence des faisceaux, mais également l’indice du substrat utilisé. Il est alors courant que ce dernier soit supérieur à l’indice du milieu dans lequel se trouve l’échantillon. Dans ce cas, à partir d’un angle d’incidence
𝜃 supérieur à l’angle critique 𝜃𝑖𝑟𝑖𝑡 = sin−1(𝑛′/𝑛), on observe une réflexion totale interne du faisceau à la
surface du substrat. La grille de lumière est alors confinée à une épaisseur de peau de quelques fractions de longueur d’onde, produisant un sectionnement en z de la zone observée : on parle de microscopie en réflexion totale interne (TIRFM) [50,51]. En éclairement structuré, cette configuration permet également d’atteindre une excellente résolution latérale [134-136,157]. Pour aller plus loin, un substrat fait d’un matériau d’indice optique plus élevé que les simples lamelles de verre (𝑛≈ 1.515), tel que l’oxyde de titane (TiO2, 𝑛≈ 2.49) ou le diamant (𝑛≈ 2.41), pourrait être utilisé. Étant donné les matériaux considérés, la fabrication de tels substrats serait difficile et onéreuse.
Figure 0-1
Configuration de réflexion totale interne pour l’éclairement
Certains matériaux diélectriques ou semi-conducteurs présentent des indices de réfraction supérieurs à 2.5 dans le visible, mais ils sont également absorbants. Leur indice de réfraction comporte une partie imaginaire (parfois notée k), qui se traduit par une décroissance exponentielle des ondes s’y propageant. Pour des coefficients de pertes assez faibles, la lumière peut tout de même traverser une faible épaisseur de matériau sans être trop atténuée1. Dans ce cas l’utilisation d’un prisme (inévitablement trop « épais ») n’est pas possible, mais d’autres stratégies peuvent être envisagées [158]. L’une d’entre elles est de tirer profit de modes guidés pouvant se propager dans des couches fines d’un matériau d’indice élevé. Nous verrons que les modes
guidés sont caractérisés par un nombre d’onde, noté 𝛼𝑚𝑜𝑑𝑒, qui est nécessairement supérieur à 𝑛𝑠𝑘𝑂 (où 𝑛𝑠 est l’indice du substrat supportant la couche « guidante » d’indice élevé). En conséquence, ces modes ne peuvent pas être directement excités par une onde incidente propagative, et réseau coupleur doit être utilisé.
Généralement, les modes guidés sont utilisés avec des matériaux transparents (et donc d’indice optique inférieur à 2.4 dans le visible), pour qu’ils puissent s’y propager sur de longues distances. Avec de matériaux à pertes, l’excitation du mode guidé par le réseau de couplage est beaucoup moins efficace. Malgré cela, la résonnance existe toujours, et elle pourrait être suffisante pour générer une grille de lumière à haute(s) fréquence(s). C’est ce que nous proposons dans ce chapitre. Notons que des plasmons de surface pourraient jouer un rôle similaire aux modes guidés dans un guide d’onde plan diélectrique. Formés niveau d’une interface métal/diélectrique, leur courbe de dispersion particulière permet dans certains cas d’obtenir des modes dont l’indice optique effectif est élevé [159,160], pouvant être utilisé pour confiner le champ électrique à des dimensions inférieures sub-diffraction [161-164]. Malheureusement, l’indice effectif est d’autant plus élevé que la couche
1 Typiquement, l’amplitude est quasiment divisée par deux à la traversée d’une épaisseur de 𝜆0 d’un matériau dont les pertes sont de 10-1
Figure 0-2
métallique est fine, ce qui pose des problèmes technologiques pour la fabrication de substrats « efficaces » pour faire de l’éclairement structuré basés sur les plasmons1.