Stratégies déployées pour contourner ces contraintes

(2) La différenciation des haplotypes hom(é)ologues sur la carte physique. Lors du criblage des banques d’ADN à grands inserts, les clones identifiés peuvent appartenir aux différents haplotypes constituant la région cible. Par exemple, pour une espèce dodécaploïde, 12 haplotypes hom(é)ologues peuvent recouvrir la région cible.

D.2. Stratégies déployées pour contourner ces contraintes

D.2.1 Utilisation d’un donneur diploïde ou d’un parent proche diploïde avec un plus petit génome

Cette stratégie a beaucoup été utilisée pour le clonage positionnel de gènes chez le blé tendre (Keller et al., 2005). Elle consiste à utiliser des génomes de blé diploïdes ou tétraploïdes à plus petit génome qui sont étroitement liés au génome du blé tendre hexaploïde. Ainsi, pour le génome A du blé hexaploïde (16 000 Mb), on peut utiliser le génome A^m du blé diploïde T. monococcum (5 600 Mb), alors que pour le génome D du blé hexaploïde, on peut utiliser l'espèce diploïde donneuse Ae. tauschii (4 400 Mb). Cette stratégie subgénomique proposée initialement par Gill et al, (1991) a été une percée essentielle en matière de clonage positionnel sur le blé. Sur cette base plusieurs gènes ont été clonés comme :

- Lr21 (Huang et al., 2003), gène de résistance à la rouille brune du blé

appartenant au génome D du blé tendre. La stratégie employée a été de réaliser un pont entre l’espèce diploïde Ae. tauschi et l’espèce hexaploïde T. aestivium pour réaliser la carte génétique. La carte physique a été réalisée à partie d’une banque de cosmides d’Ae. tauschi.

- Lr10 (Feuillet et al., 2003) est aussi un gène de résistance à la rouille brune. Deux gènes candidats ont été identifiés sur l’espèce diploïde T. monococcum et des sondes ont été dérivées de ces deux gènes pour cribler la banque BAC de l’espèce hexaploïde.

- Pm3b (Yahiaoui et al., 2004) est un gène de résistance à l’oïdium. Ce gène a

été cloné en dérivant des marqueurs de l’espèce diploïde T. monococcum et l’espèce tétraploïde T. durum. L’haplotype candidat dans l’espèce diploïde présentait une conservation partielle avec l’haplotype de l’espèce hexaploïde. Cette conservation a été suffisante pour dériver des marqueurs spécifiques et cribler la banque BAC de l’espèce hexaploïde.

Cette stratégie ne peut s’appliquer à toutes les plantes. Par exemple, chez la canne à sucre, nous ne connaissons pas d’espèces proches diploïdes dans le genre Saccharum. Seules des espèces polyploïdes sont connues.

D.2.2 Synténie avec les plantes modèles

Cette stratégie est basée sur la synténie existante entre les génomes d’une même

famille botanique, par exemple la famille des Poacées, la famille des Légumineuses ou la famille des Fabacées (Gale & Devos, 1998; Choi et al., 2004; Panjabi et al., 2008). Par comparaison des cartes génétiques avec une espèce modèle souvent diploïde et à petit génome, des marqueurs moléculaires vont être dérivés dans la région orthologue de l’espèce modèle pour densifier la carte génétique de la région du gène candidat dans l’espèce étudiée. Cette stratégie a été utilisée avec succès pour le clonage d’un gène de résistance chez l’orge : Rpg1 (Kilian et al., 1995; Han et al., 1999; Brueggeman et al., 2002). La synténie existante entre le riz et l’orge a été utilisée pour augmenter la densité de la carte génétique autour du gène Rpg1, même si Rpg1 ne présente pas d’orthologue chez le riz (Brueggeman et al., 2002). Cette stratégie a aussi été utilisée dans la construction de la carte fine du gène de résistance Bru1 chez la canne à sucre(Le Cunff et al., 2008). La synténie existante entre la canne à sucre et le sorgho, et, la canne à sucre et le riz, a été utilisée pour dériver des marqueurs moléculaires

D.2.3 Analyse de Ségrégation en mélange

La technique BSA (Bulk Segregant Analysis) décrite par Michelmore (1991) est une méthode simple et rapide qui permet d’identifier des marqueurs moléculaires liés à un gène majeur. Elle consiste à comparer des mélanges (bulks) d’ADN constitués d’individus dont le phénotype est identique pour un caractère donné (par exemple résistant ou sensible pour une résistance à un pathogène) mais aléatoire pour les autres caractères. Cette technique permet donc d’obtenir des marqueurs locus-spécifiques. Elle est généralement associée à des techniques de marquage basé sur la PCR, comme les AFLP qui permettent de générer un grand nombre de marqueurs rapidement. La probabilité d’identifier des marqueurs liés à un gène avec cette méthode dépend de plusieurs facteurs, dont le taux de recombinaison entre le gène et le marqueur, la taille du bulk et le type de descendance.

Cette technique a été utilisée avec succès dans le cadre du clonage du gène de résistance à la rouille brune chez le blé, Lr21 (Huang et al., 2003). Plus récemment, un autre gène de résistance du blé à l’oïdium a été isolé grâce a cette technique (Xu et al., 2010). Dans les premières étapes du clonage du gène Bru1 de la canne à sucre, cette technique a permis

Chromosome 4 du maïs

Bru1

Chromosome 5 du maïs Groupe de liaison VII-1 de R570

Groupe de liaison D du sorgho

Chromosome 2 du riz

Chromosome 4 du maïs

Bru1

Chromosome 5 du maïs Groupe de liaison VII-1 de R570

Groupe de liaison D du sorgho

Chromosome 2 du riz

Chromosome 4 du maïs

Bru1

Chromosome 5 du maïs Groupe de liaison VII-1 de R570

Groupe de liaison D du sorgho

Chromosome 2 du riz

Figure 1.16. Relations synténiques entre le groupe de liaison VII du cultivar R570 et les régions orthologues chez le sorgho, le maïs et le riz (Asnaghi et al., 2000).

La position des sondes est indiquée par une ligne horizontale, courte lorsqu’elles ne s’hybrident pas sur l’ADN de canne à sucre, longue lorsqu’elle révèle un marqueur sur le groupe d’homologie VII et/ou un autre groupe d’homologie. Les lignes horizontales ou diagonales entre les fragments chromosomiques indiquent des loci colinéaires entre la canne et les autres graminées. Les lignes épaisses indiquent les sondes qui sont précisément localisées sur les segments orthologues et les lignes fines indiquent celles dont la localisation est plus imprécise.

d’identifier des marqueurs entourant le gène (Asnaghi et al., 2004).