Cartographie physique de l’haplotype porteur du gène Bru1

Les contraintes majeures d’un projet de clonage positionnel chez la canne à sucre sont son haut niveau de polyploïdie qui induit une taille de génome (10 Gb) et une redondance (2n = 12 X) très importantes.

La forte redondance implique d’utiliser des stratégies très lourdes pour la réalisation de cartes génétique et physique d’un haplotype spécifique parmi plus de dix autres. Pour contourner cette contrainte, une stratégie exploitant des espèces diploïdes apparentées a été utilisée avec succès chez d’autres espèces polyploïdes en particulier chez le blé où plusieurs gènes de résistance ont été clonés grâce à cette stratégie (Feuillet et al., 2003; 2003; Yahiaoui et al., 2004). Cette stratégie ne peut être appliquée à la canne à sucre parce qu’il n’existe aucune espèce diploïde dans le genre Saccharum.

Pour avancer dans le clonage de Bru1 chez la canne à sucre, Le Cunff et al (2008) ont utilisé les relations synténiques existantes entre la canne à sucre et deux espèces diploïdes de genres proches, le sorgho et le riz. Cette stratégie a été fructueuse et a permis de développer une carte génétique fine de la région entourant Bru1 et une carte physique partielle de l’haplotype cible. Toutefois, la présence d’une insertion spécifique à l’haplotype cible a empêché de poursuivre cette stratégie pour finaliser la carte physique.

dans une moindre mesure, avec les régions orthologues du sorgho et du riz (Garsmeur et al, en presse). Dans notre étude, nous avons exploité cette très bonne conservation des gènes entre les différents haplotypes hom(é)ologues pour combler l’espace de droite de la carte physique de l’haplotype cible. Le fait que l’haplotype cible présente une région absente des autres haplotypes hom(é)ologues chez le cultivar R570 n’a pas permis d’exploiter cette stratégie pour l’espace de gauche. Aucune région orthologue à l’insertion chez le sorgho et le riz n’a pu être identifiée. De la même façon, des gènes de résistance à la rouille chez le blé Lr10 (Feuillet et al., 2003), Lr21 (Huang et al., 2003) et Pm3 (Yahiaoui et al., 2004) et le gène Rpg1 chez l’orge (Brueggeman et al., 2002) ne présentent pas d’orthologue dans le génome du riz. Seules les techniques classiques de marche sur chromosome peuvent donc être utilisées pour combler l’espace de gauche.

La grande taille du génome est une autre contrainte qui implique lors des étapes de cartographie physique de manipuler un grand nombre de clones BAC. Pour construire une banque BAC correspondant à une couverture du génome totale de 5 X avec une moyenne d’inserts de 100 Kb, le nombre de clones BAC pour un cultivar moderne de canne à sucre comme R570 est de 500 000. En comparaison, chez le sorgho, 80 000 clones BAC suffisent.

Pour construire la première carte physique de la région de Bru1, Le Cunff et al, (2008) ont utilisé deux banques BAC représentant 2,7 fois le génome total de R570 et 4,1 fois la région de Bru1. Cette couverture étant un peu faible, nous avons entrepris d’augmenter le taux de couverture en produisant de nouveaux clones BAC avec une nouvelle enzyme de restriction pour éviter les biais de représentation dû à l’enzyme de clonage. Pour enrichir la banque en haplotype cible, nous avons utilisé, comme Le Cunff et al, (2008), l’ADN de descendants issus de l’autofécondation du cultivar R570 présentant deux copies de la région cible. Cette banque comprend 119 040 clones BAC ce qui correspond à une couverture représentant 1,6 fois le génome total et 3,2 fois la région de Bru1. En cumulant les trois banques BAC, la région cible est représentée statistiquement 7,3 fois. Cette couverture n’est pas encore très importante mais des couvertures légèrement inférieures ont permis d’identifier des gènes recherchés. Par exemple, le clonage chez l’orge des gènes Rpg1, Rpg5 et du gène Rph7 a été réalisé avec une banque d’une couverture du génome totale de 6,3 X (Brueggeman et al., 2002; Brunner et al., 2003; Brueggeman et al., 2008). Le gène Vrn1 chez le maïs a été cloné avec une banque d’une couverture du génome total de 5,6 X (Yan et al., 2003).

Cette approche a été fructueuse car elle nous a permis de combler un des deux espaces de la carte physique de l’haplotype cible et d’avancer dans le deuxième. Toutefois, la

couverture reste encore modeste, la production de clones BAC supplémentaires nous semble donc une bonne stratégie pour poursuivre le travail visant à combler l’espace non couvert de l’haplotype cible.

Il a été montré que certaines séquences d’organisme eucaryote sont inclonables dans un système procaryote comme Escherichia coli (Kang & Cox, 1996). La nature de telles séquences n’est pas bien connue mais certaines ont déjà été décrites : la présence de longue région répétée, des séquences riches en A-T ou des séquences capables de former des structures secondaires anormales comme l’ADNz (ADN s’enroulant dans le sens inverse) (Kang & Cox, 1996; Ravin & Ravin, 1999; Razin et al., 2001). La réalisation de banque BAC passe par la transformation de cellule d’E. coli. Donc, même avec une couverture du génome totale suffisante, un tel type de région ne sera jamais représenté dans une banque BAC. Bien que nous n’ayons pas d’éléments pour penser que nous soyons dans une telle région, cette hypothèse ne peut être exclue. L’utilisation des levures (organisme eucaryote) permettrait de contourner ce problème car elles procureraient une meilleure stabilité de ce type de séquence dans les vecteurs de transformation (Gardner et al., 2002). Ceci impliquerait d’utiliser des banques YAC (Yeast Artificial Chromosome) avec des inserts beaucoup plus grands que ceux des banques BAC.