Endoglucanase de la région de Bru1 (gène 12)

B.1. Implication des endoglucanases dans les mécanismes de résistance

Les endoglucanases sont des enzymes appartenant au groupe des glycosides hydrolases (EC3.2.1) comprenant plus de 150 enzymes différentes. Ces enzymes interviennent dans divers processus métaboliques comme le métabolisme des parois cellulaires, dans les mécanismes de défense et dans la voie de biosynthèse et d’hydrolyse de l’amidon (Minic, 2008).

Il existe deux types d’endoglucanases qui se différencient par le substrat qu’elles hydrolysent :

- β-1,3- endoglucanase : hydrolyse le β-1,3-glucane. Ces enzymes interviennent principalement dans les interactions plantes/ microorganismes (Münch-Garthoff et al., 1997; Lepoivre, 2003; van Loon et al., 2006). Leur action est de deux types : (1) une dégradation des parois fongiques entraînant la réduction de la croissance de l’agent pathogène et (2) une libération de molécules signal du parasite (éliciteur) permettant d’amplifier la réponse de défense (Lepoivre, 2003).

- β-1,4- endoglucanase : hydrolyse le β-1,4-glucane. Ces enzymes interviendraient dans des mécanismes cellulaires de développement de l’organisme (Minic, 2008). Sa principale fonction serait dans l’élongation des parois des cellules en participant à la formation de la cellulose, principal constituant des parois des cellules végétales (Levy et al., 2002). De part leur fonction, ces gènes sont très conservés entre différentes espèces (Minic, 2008). Ce type de gène n’a pas été montré comme intervenant dans les mécanismes de résistance.

La différence de structure de ces deux enzymes dans une même espèce peut être très difficile à caractériser (Henrissat et al., 2001). Une étude portant sur deux endoglucanases d’orge, une β-1,3- endoglucanase (fonction dans les mécanismes de défense) et une β-1,4- endoglucanase (fonction dans la synthèse des parois cellulaires), a montré que ces deux protéines avaient une structure secondaire très proche (Varghese et al., 1994). Les différences se situent sur quelques acides aminés dans les sites catalytiques de l’enzyme qui entraînent une spécificité du substrat différente.

End oglu cana se_ca s 1 MA PPVRR SSST ATVSRLALA AAIL CLTA GGNTVAAFN YADA LDKA LLFFE AQRS GKLPAG-QQRVTW RGDS GLSD GSAAG

Bet a_1_4_so rgho 1 MA PMRRS SSKA MVSS LAVALAAVL CLTA GGNG VAAFN YADA LDKA LLFFE AQRS GKLP PRPLQRVTW RGDS GLSD GSAAG

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Bet a_1_3_ri z 1 -- --- ---- ---- --- ---- ---- -MGGAHGVCYGVV GNNL PSRSEVVQL YKSK GISA MRIYYPDQEALAA LRGSG

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Bet a_1_3_ar abido psis 1 -- --MDS KLIR FAVVIMLLSIQIFCTAGVAGDITGDCYGRN GNNL PTPADTVAL YKSN NIDA IRMYE PFAD MLEA LRGSG

con sensus 1 . .. .. .. .... .... .... ... . *... .... ... .... .*.. .. .*... .... .*.. ... End oglucana se_ca s 8 0 VD LAGGY YDAG DNVK FGLPM AFTV TMLS WSVL EFMPG GAAG ---- --- ---- ---- ---R AAVRW GADY LLKA AAAAP

Bet a_1_4_so rgho 8 1 VD LSGGY YDAG DNVK FGLPM AFTV TMLS WSVL EFMPG AAAG ---- --- ---- ---- ---R AAVRW GADY LLKA AAAAP

Bet a_1_4_ri z 6 6 VD LAGGY YDAG DNVK FGLPM AFTV TMLS WSVI EFGDMMPAR RSSF LGGIF GGGG VAQL DNAR AAVRW GADY LLKA ATATP

Bet a_1_4_pe uplie r 7 4 VNLVGGY YDAG DNVK FGLPM AFTTTLLAWSVI EFGSSMQNQ IEN- --- ---- ---- --AK AAIRWSTDY LLKA ATATP

Bet a_1_4_ar abido psis 7 0 VD LSGGY YDAG DNIK FGFPM AFTTTMLS WSII DFGKTMGPE LRN- --- ---- ---- --AV KAVKW GTDY LLKAT-AIP

Bet a_1_3_so rgho 5 2 IAVILDV GGVD AVRA LAGSA SVAA DWVQ ANVQ AYQR- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- --- Bet a_1_3_ri z 5 2 IAVIVDV GDKGAVAN LANNP SAAA DWVR NNVQ AYWP- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- --- Bet a_1_3_pe uplie r 7 2 IGIIVGL GN-GYLKE IAVGE DRAMNWIK ENVQ PFLP- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- --- Bet a_1_3_ar abido psis 7 7 LLVAFGP RN-EDIQS LAHDPAAAT NFVSTWIT PYQN- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- --- con sensus 8 1 .. ... .... .... ... .... .... .... .... ... .. ... .... .... . . . End oglucana se_ca s 14 0 DALYVQV ADPNRDHQCWERP EDMD TPRDVYKV TPDKP GSDV AGET AAALA AASL VFRT CDPAYSSKL LQTA QKVF DFADR

Bet a_1_4_so rgho 14 1 HALYVQV ADPNRDHQCWERP EDMD TPRDVYKV TPDMP GSDV AGET AAALA AASL VFRT CDPAYSAKL LQTA QKVF DFADR

Bet a_1_4_ri z 14 6 DTLYVQV ADPY QDHRCWERP EDMD TPRSVYKV TPQSP GSDV AGET AAALA AASI VFRVSDPSYSAKL LDAA QLVF DFADK

Bet a_1_4_pe uplie r 13 8 DTLYVQV GDPNMDHRCWERP EDMD TPRNVYKV TIQNP GSDV AAET AAALA AASI VFKESDPSYSTKL LHTAMKVF DFADR

Bet a_1_4_ar abido psis 13 3 GV VFVQV GDAY SDHNCWERP EDMD TLRTVYKIDRAHP GSDV AGET AAALA AASI VFRK RDPAYSRLL LDRATRVFAFANR

Bet a_1_3_so rgho 8 8 DV LIRYI AVGN EVGPGDG-- AAAL LLPA MRNVHAALV SAGLDGSI KVSTAVKMD AFADTFPPSRGAF A---QGYM ADVAR

Bet a_1_3_ri z 8 8 SVFIRYI AVGNQLGPGD--- -MGT ILPA MQNLYNALV SAGLSNSI KVSTAVKMDVITN SFPPSHGVF RPDLQRFI VPIAQ Bet a_1_3_pe uplie r 10 7 GT NIAGI AVGN EILG GDDHE LWEV LLPA VKNVYDALR RLDLTKVV EVSSP HSEAVFTN SFPPSSCVF REDV SIYM KPLLQ Bet a_1_3_ar abido psis 11 2 DVAIKWITIGN EVFPGEI-- -AQF VAAA IKNVNVALT NSGVTG-I SVTTV LAMT ALTN TYPPSAATFLPDL TEIM TEITS con sensus 16 1 .. ... .... .... ... .... . .. .... ... .... .... ... .... .... ..*. ... .. . .... ... End oglucana se_ca s 22 0 YR GSYSDSLSSVACP FYCSY SGYH DELL WAAAWLHMA TAAA GN-- ---SS DVYL SYIYSNGHNLGAE QDDF TFSW DDKRV

Bet a_1_4_so rgho 22 1 YR GSYSDSLSSVACP FYCSY SGYH DELL WAAAWLHMA TAAA AAPA GNSSS DVYL SYIYSNGHNLGAE QDDF TFSW DDKRV

Bet a_1_4_ri z 22 6 YR GSYSDSLSSVVCP FYCSHS-YH DELL WAAS WLHLA SPEK KD-- --- -VYL SYIGSNGHALGAE QDDF TFSW DDKRV

Bet a_1_4_pe uplie r 21 8 YR GSYSNSLNSVVCP FYCSY SGYQDELL WGAS WIHRA SQ-- ---- ----N GSYL TYIQSNGHTMGSDDDDY SFSW DDKRP Bet a_1_4_ar abido psis 21 3 YR GAYSNSLYH AVCP FYCDFNGYQDELL WGAAWLHKA SRKR ---- --- -AYR EFIV KNEV ILKAG DTIN EFGW DNKHA Bet a_1_3_so rgho 16 3 FLADTGA PLLA NVYP YFAYR DDPR NISLEFAS--- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- --- Bet a_1_3_ri z 16 4 FLANTMS PLLV NVYP YFAYR DNPRDIPLNYAT--- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- --- Bet a_1_3_pe uplie r 18 7 FF SQIGS PFYI NAYP FLAYKSDPE HIDINYAL --- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- --- Bet a_1_3_ar abido psis 18 8 IL SETNS PLMTNIYP YFAYASDPY HISLDYAS--- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- --- con sensus 24 1 .. .... .... ..* ... . .... .... ..*. ... . ... ... .... .... .... .... ... End oglucana se_ca s 29 5 GT KVLLS KAFLQGIG KGKSDDALRLYKA HADTYVCSL VPGAAGFQ QS--Q YTPG GLLFKEGD SNMQY VTST AFLL LAHAK Bet a_1_4_so rgho 30 1 GT KVLLS KAFLQGKG ---NVDALRVYKA HADTYVCSL VPGAGGSQ SSSSQ FTPG GLLFKEGD SNMQY VTST AFLL LAHAK Bet a_1_4_ri z 29 7 AT KGFLQ S--- ---- ---RADGLQLYKA HTDNYICSL VPGANG-- -FQSQ YTPG GLLFKEGD SNMQY VTST AFLL LTYAK Bet a_1_4_pe uplie r 28 8 GT KILLS KEFLEKTT ---EEFQLYKSHSDNYICSL IP-- -GTS SFQAQ YTPG GLFYKASE SNLQY VTSTTFLL LTYAK Bet a_1_4_ar abido psis 28 3 GI NVLIS KEVLMG-- ---KAEYFE SFKQ NADGFICSI LP-- -GIS HPQVQ YSRG GLLV KTGGSNMQHVTSL SFLL LAYSN Bet a_1_3_so rgho 19 5 -- --- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- ---FRPG AATVTDGG NGLAYTNLL DAMVDAIYA Bet a_1_3_ri z 19 6 -- --- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- ---FQP-GTTV RDND SGLTYTNLF SAMVDAVYA Bet a_1_3_pe uplie r 21 9 -- --- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- ---FKS- NKGILDAKTNLHYDNMF EAQVDAAYA Bet a_1_3_ar abido psis 22 0 -- --- ---- ---- --- ---- ---- ---- --- ---- ---- ---FKSN TPVVIDG- -DLYYNNMF EAMVDGFNA con sensus 32 1 .. ... . .. . ... .... ... ... .... . . . .... .... .... ... .... .... .... End oglucana se_ca s 37 3 SLSSAGP AGVVSCGGGAAVPASAL VAVA KRQV DYILGANPA GMSY MVGFG-ARY PRHV HHRG ASMPS VRDH PAHI ACDEG

Bet a_1_ 4_so rgho 37 8 SLAGAG- --AM VSCGGAAVPASAL VAVA KRQV DYILGANPA AMSY MVGFG-ARY PRHV HHRG ASMPS VRDH PARI ACDEG

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Figure 3.3. Alignement des séquences en acides aminés de l’endoglucanase présente sur l’haplotype cible de la région de Bru1 de canne à sucre et des β-1,4- endoglucanases et des β-1,3- endoglucanases présentes chez le sorgho, le riz, le peuplier et l'arabette.

B.2. Analyse structurale de l’endoglucanase de la région de Bru1

Le gène codant pour l’endoglucanase est présent sur six haplotypes hom(é)ologues (Figure 3.1). Ce gène comprend 3 exons et 2 introns. Sa taille moyenne génomique sur les différents haplotypes hom(é)ologues est de 1,8 kb pour un transcrit moyen prédit de 1,5 kb. Afin de déterminer si cette glucanase appartient au groupe des β-1,3- ou des β-1,4-endoglucanases, nous avons comparé sa séquence nucléotidique avec les endoglucanases présentes dans les bases de données. Les alignements de séquences montrent une identité supérieure à 60% avec des β-1,4-endoglucanases, l’homologie la plus forte correspondant à une β-1,4-endoglucanase du sorgho orthologue à la région de Bru1 (96 % d’identité, Figure 3.1). Une homologie de séquence a également été retrouvée (72 % d’identité) avec la β-1,4-endoglucanase de riz présente dans la région orthologue du chromosome 2 (Figure 3.1). Pour compléter cette analyse, nous avons réalisé un alignement des séquences en acides aminés des β-1,4-endoglucanases et des β-1, 3-endoglucanases de sorgho et de riz et de deux dicotylédones, Arabidopsis thaliana et Populus trichocarpa, les β-1,4-endoglucanases constituant une famille de gènes très conservée entre espèces (Figure 3.3). L’endoglucanase au niveau de la région de Bru1 présente une très forte homologie de séquence avec les endoglucanases de type 1,4 des deux Poacées mais aussi avec les endoglucanases de type β-1,4 des deux espèces des dicotylédones. Ce résultat est conforté avec l’arbre phylogénétique dérivé de l’alignement des séquences en acides aminés (Figure 3.4). L’ensemble de ces résultats confirme que la glucanase codée par le gène 12 appartient au groupe des β-1,4-endoglucanases et n’interviendrait donc pas dans les mécanismes de résistance.