2.1.2 Stratégie de fabrication de dimères dynamiques . . . 40 2.2 Protocole d’auto-assemblage des dimères . . . 41 2.2.1 Modification de la chimie de surface . . . 41 2.2.2 Conjugaison de brins d’ADN sur une nanoparticule d’or . . . 42 Conjugaison d’un unique brin d’ADN sur l’or . . . 42 Saturation d’une particule d’or avec des brins d’ADN . . . 42 2.2.3 Purification des monomères par électrophorèse . . . 42 2.2.4 Formation des dimères et étude morphologique par déplace-
ment électrophorétique . . . 44 2.3 Caractérisation morphologique par microscopie électronique cryogé-
nique en transmission (cryo-EM) . . . 46 2.3.1 Principes du cryo-EM . . . 46 Microscopie électronique . . . 46 Microscopie électronique cryogénique . . . 46 2.3.2 Évaluation de la pureté des échantillons . . . 47 2.3.3 Évaluation des diamètres des dimères . . . 47 2.3.4 Estimation des distances interparticules . . . 48 Calcul de la fonction de projection . . . 48 Estimation de la distance bord-à-bord . . . 49 2.4 Étude de la structure dynamique . . . 50 2.4.1 Réversibilité et sensibilité . . . 50 2.4.2 Reproductibilité . . . 52 2.5 Conclusions . . . 54
F
abriquer des nanostructures dont la forme et les propriétés physiques sont sensibles àleur environnement chimique est essentiel dans le développement de nouvelles plate- formes thérapeutiques [151–153] et de capteurs biochimiques [1,23,154]. Grâce à sa plasti- cité structurelle ainsi qu’à ses interactions réversibles, l’ADN est un très bon candidat pour fabriquer des nano-objets chimiquement sensibles, dynamiques et déformables [38, 39].Un moyen de convertir une information chimique en un signal optique macroscopique mesurable est de fonctionnaliser l’ADN avec des entités optiquement actives. Par exemple, hybrider des paires de chromophores électromagnétiquement couplés a permis le dévelop- pement de balises moléculaires [21] et le suivi de déformations bi- et tridimensionnelles de nanostructures en utilisant le couplage FRET [155, 156]. Grâce à des propriétés op- tiques remarquables telles que leur résonance plasmon, leur photostabilité [128] et leurs propriétés photothermiques [1,4], les nanoparticules d’or sont une alternative intéressante aux molécules fluorescentes. Si la conception d’assemblages dynamiques entre des nano- particules d’or et de l’ADN a déjà été démontrée dans la littérature [23, 143, 148, 155], l’inhomogénéité des échantillons associée à la non-sphéricité des particules et à l’agréga- tion des particules sur les substrats de microscopie électronique ont empêché une analyse quantitative des changements conformationnels.
Dans ce chapitre, nous présentons la structure dynamique la plus simple possible, c’est- à-dire un dimère de nanoparticules d’or assemblées par un unique brin d’ADN possédant une boucle en épingle à cheveux. Nous effectuons une mesure quantitative de la variation de la distance interparticule par microscopie électronique cryogénique en transmission, entre une structure boucle ouverte et une structure boucle fermée. De plus, l’échafaudage est conçu de telle sorte que la réaction soit réversible à température ambiante. Finalement, une étude cinétique démontre que le changement de conformation est asymétrique dans la mesure où la fermeture de la boucle est favorisée par rapport à l’ouverture.
2.1
Stratégie utilisée
Pour contrôler la fabrication d’une nanostructure or-ADN par auto-assemblage, plu- sieurs étapes successives sont nécessaires. Bien que ce chapitre se focalise sur des parti- cules de 8 nm de diamètre, certaines descriptions faites dans la suite seront aussi valables pour des sphères d’or de 40 et 60 nm de diamètre, ce qui sera indiqué lorsque le cas se présentera. Toutes les séquences d’ADN et les protocoles expérimentaux sont détaillés dans l’annexe A.
2.1. Stratégie utilisée 39
2.1.1
Structure des dimères
Il existe plusieurs méthodes pour induire l’auto-assemblage des dimères de nanoparti- cules. L’approche que nous utilisons consiste à assembler deux particules portant préfé- rentiellement à leur surface un unique brin d’ADN, l’un étant complémentaire de l’autre. Lorsque les deux particules se rencontrent, les deux brins s’hybrident pour former une double hélice qui relie ainsi les deux particules. Etant donné que les particules ne portent majoritairement qu’un seul brin d’ADN à leur surface, la synthèse fournira principalement des dimères sans se poursuivre pour former des structures plus larges.
Par ailleurs, il est possible d’orienter l’assemblage d’un dimère grâce au placement particulier de groupements thiols sur les brins d’ADN. En effet, l’hybridation de brins complémentaires d’ADN se fait selon un sens précis et la terminaison 50 d’une séquence
se retrouvera face à la terminaison 30 de l’autre brin. Cela signifie que si les deux groupe- ments thiols se situent sur les mêmes terminaisons 50 ou 30, alors le double brin d’ADN sera parallèle à l’axe du dimère, comme schématisé sur la figure 2.1a. En revanche, si les groupements thiols se situent aux extrémités opposées, un en 50 et un en 30, alors le double brin d’ADN sera perpendiculaire à l’axe du dimère (figure 2.1b).
Figure 2.1 – Représentation schématique de dimères de nanoparticules reliées par différents écha- faudages d’ADN possibles. Le double brin d’ADN peut être orienté parallèlement (a) ou perpendiculairement (b) à l’axe du dimère.
Dans nos expériences, afin de minimiser la distance interparticule en position fermée, nous avons opté pour la configuration dans laquelle l’échafaudage d’ADN, liant les parti- cules, est perpendiculaire à l’axe du dimère. Par ailleurs, nous cherchons à fabriquer des dimères dynamiques, c’est-à-dire dont la distance interparticule peut varier. Pour cela, nous utilisons une séquence d’ADN qui possède une tige-boucle (hairpin loop ou stem
loop en anglais) dans sa structure comme schématisé par la structure 4 de la figure 2.2.
Dans ce cas de figure, la boucle est fermée et les particules sont donc proches l’une de l’autre. En revanche, si la boucle est ouverte, la distance entre les particules est plus grande (structure 5 de la figure 2.2).
Finalement, nous avons choisi dans notre séquence d’ADN d’introduire 9 bases dans la séquence du brin S (visible sur les structures 1 et 4 de la figure 2.2) permettant d’éloigner la tige de la surface de la particule. En effet, sans ces bases, le squelette sucre-phosphate de l’ADN double brin, chargé négativement, défavorise l’approche puis l’accrochage du brin d’ADN sur les nanoparticules d’or.
Figure 2.2 – Schéma de la stratégie de synthèse de dimères dynamiques.
2.1.2
Stratégie de fabrication de dimères dynamiques
Le schéma de la figure 2.2 résume la stratégie de fabrication des dimères composés de deux nanoparticules d’or de 8 nm de diamètre. Ils sont fabriqués dans deux conforma- tions spatiales différentes (tige-boucle fermée (4) ou ouverte (5)) en utilisant un unique échafaudage d’ADN. Une moitié de cet échafaudage d’ADN (séquence S) possède une tige-boucle dont la tige mesure 10 paires de bases et la boucle 20 bases, pouvant s’ouvrir lorsqu’elle s’hybride avec le brin T (structures 1 et 3 sur le schéma). La séquence S de 100 bases peut également s’hybrider à un ADN complémentaire C de 50 paires de bases. Comme démontré précédemment dans de nombreux articles [19, 20, 95–99, 155], nous utilisons l’électrophorèse pour séparer des particules de 8 nm portant un simple brin d’ADN trithiolé (S, C ou S+T), donnant les structures 1, 2 et 3 du schéma. Cette technique est compatible avec des particules de diamètre allant jusqu’à 40 nm tant que la longueur du brin d’ADN attaché augmente suffisamment le volume hydrodynamique pour obtenir une séparation efficace [20, 121]. Pour cette raison, avant de faire l’électrophorèse, la séquence C est hybridée sur 15 paires de bases à un simple brin dit "allongeur" L afin d’optimiser la purification des sphères monoconjuguées.
Les structures fermée (4) et ouverte (5) sont obtenues en hybridant respectivement les structures 1 et 2 d’une part et 2 et 3 d’autre part, avant la deuxième étape de purification électrophorétique. Les séquences S et C possèdent leur groupement trithiol respectivement du coté 50 et 30 afin de minimiser la distance entre les particules dans 4, avec le double brin de 50 paires de bases résultant de l’hybridation perpendiculaire à l’axe du dimère, comme annoncé auparavant [20, 99].