5.4 Fermeture de dimères A11E6c
5.4.3 Résultats
Figure 5.6 – Distribution du rapport ∆λ/λ mesuré à l’aide d’un spectromètre sur des dimères ou- verts et dont la chimie de surface est à base du ligand A6E11c, lors d’une incubation de 12 heures avec un ADN témoin (a) ou avec l’ADN cible (b). c) Histogramme re- présentant la différence entre les histogrammes obtenus avec l’ADN cible et un ADN témoin.
Expérience témoin. Pour rappel, le but des expériences consistant à incuber les di- mères avec un ADN témoin, c’est-à-dire non hybridant, est d’étudier la stabilité des di- mères dans la chambre microfluidique, dans les mêmes conditions expérimentales que les expériences visant à fermer la boucle. Le paramètre spectral analysé étant défini comme
λ4−λ1
λ1 , un système stable devrait donner un paramètre égal à zéro. La figure 5.6a montre
la distribution de ∆λ/λ lors de l’expérience témoin.
On remarque que l’on obtient une distribution quasiment centrée autour de 0, mais très légèrement décalée vers le rouge (environ 2 nm). Ce décalage est bien moins important que celui mesuré lors des expériences utilisant une chimie de surface en E6m, même lors d’expériences avec des temps d’incubation plus courts. De plus, l’histogramme est beau- coup moins étalé. Il n’y a donc pratiquement plus de vieillissement des nanostructures. Les deux principales raisons sont d’une part la stabilité accrue des dimères grâce à la
5.5. Conclusions 135
chimie de surface en A11E6c, et d’autre part l’impossibilité pour l’ADN non hybridant de s’absorber sur la surface des nanoparticules en raison de la chaîne alkyle du ligand [24].
ADN cible. La figure 5.6b montre l’histogramme de ∆λ/λ lorsque les dimères sont incubés avec l’ADN cible destiné à fermer la structure en tige-boucle. On remarque que l’histogramme ressemble fortement à celui de l’expérience témoin et est centré autour de la même valeur. L’histogramme de la figure 5.6c obtenu en soustrayant l’histogramme cor- respondant à l’ADN témoin à celui de l’ADN cible confirme leur très grande similitude. En utilisant le test de la somme des rangs de Wilcoxon, on démontre que les distributions utili- sant l’ADN cible et celles utilisant l’ADN témoin ne sont pas significativement différentes.
En conclusion, nous avons démontré que l’utilisation d’une chimie de surface à base d’alkyle-PEG permettait de s’affranchir des phénomènes de vieillissement des dimères. Toutefois, l’absence de décalage spectral en présence de l’ADN cible indique qu’il n’est pas possible de fermer le dimère en présence du ligand A11E6c. Deux raisons peuvent expliquer ce phénomène :
- premièrement, la gêne stérique accrue (ligand plus long) et l’hydrophobie des chaînes alkyles peuvent empêcher l’ADN cible de s’approcher de l’échafaudage d’ADN, et ce même à 400 mM en NaCl, et
- deuxièmement, des mesures spectrales complémentaires effectuées sur des dimères pré- sentant une boucle fermée ont donné des réponses optiques de dimères ouverts, indiquant que la tige d’ADN n’est pas stable en présence du ligand A11E6c.
Ainsi, même si l’ADN cible réagit avec l’échafaudage dynamique, il est peu probable que cela se traduise par un décalage spectral du dimère. Ceci conforte l’idée de délocaliser le site reconnaissance de l’analyte à quelques dizaines de nanomètres des particules d’or.
5.5
Conclusions
Nous avons étudié dans ce chapitre les propriétés optiques de dimères de nanoparticules d’or de 40 nm de diamètre, avec différentes chimies de surface, afin de suivre leur déforma- tion à l’échelle du nanomètre lorsque l’on modifie la force ionique locale. L’échafaudage d’ADN étant identique dans les différentes structures, les différences de comportement obtenues entre les différents dimères peuvent être directement liées à la structure de la chimie de surface. Nous avons pu déterminer des comportements différents entre les diffé- rents ligands. Notamment, le ligand A11E6c stabilise très fortement les dimères vis-à-vis de la force ionique.
Le fait que l’étude porte sur un grand nombre de dimères nous a permis de discriminer deux populations de structures, dont une semble contrainte par son environnement (brin d’ADN ou substrat), réduisant la gamme dynamique de distances interparticules des di- mères.
surface provient à la fois d’effets stériques (lorsque les particules sont au contact) et d’ef- fets électrostatiques (quand elles ne le sont pas). L’étude de stabilité des dimères dont la distance entre les particules est maintenue par un brin d’ADN a montré que les in- teractions électrostatiques étaient principalement contrôlées par les charges effectives des particules d’or. Cela a également permis de mettre à jour d’autres paramètres régissant la stabilité d’une nano-structure auto-assemblée, comme les interactions hydrophobes- hydrophiles entre les ligands et l’échafaudage l’ADN.
Nous avons finalement tenté de fermer la structure tige-boucle de l’échafaudage à très forte force ionique en utilisant le ligand A11E6m. Cela nous a permis de nous affran- chir du vieillissement des structures et des adsorptions non-spécifiques sur la surface des nanoparticules. La structure telle quelle ne permet pas à un ADN cible d’accéder à la tige-boucle d’ADN confinée entre les particules, pour des raisons à la fois stériques et d’hydrophobie.
L’utilisation de ce protocole expérimental combiné avec l’étude plein champ par caméra CCD pourrait permettre de tester de nombreuses chimies de surface afin de déterminer celle qui fournirait à la fois une bonne stabilité vis-à-vis de la force ionique et du vieillis- sement, et une bonne réactivité de l’échafaudage d’ADN.
CHAPITRE
6
Perspectives et conclusion générale
Table des matières
6.1 Influence d’autres stimuli extérieurs : cas particulier de la température 138 6.1.1 Protocole expérimental. . . 138 6.1.2 Spectroscopie d’objets uniques en fonction de la température . 140 Étude de la longueur d’onde de résonance moyenne . . . 140 Variation de la longueur d’onde de résonance au cours du deuxième
cycle . . . 142 6.1.3 Conclusion et perspectives . . . 142 6.2 Analyse temporelle de clignotements de dimères . . . 143 6.2.1 Observation sur la caméra CCD couleur . . . 143 6.2.2 Analyse spectrale . . . 145 6.2.3 Conclusion et perspectives . . . 146 6.3 Conclusion générale . . . 147
D
ans cette dernière partie, nous allons décrire des résultats préliminaires ouvrant desperspectives nouvelles sur l’étude de dimères dynamiques : l’influence de la tempé- rature sur la morphologie et la stabilité de ces nanostructures ; mais aussi l’observation d’événements transitoires indiquant un comportement bistable. Ces données seront com- plétées de la conclusion générale de cette thèse et des perspectives qu’elle ouvre.6.1
Influence d’autres stimuli extérieurs : cas par-
ticulier de la température
L’utilisation de nanoparticules dans des applications thérapeutiques est en plein essor grâce à leurs propriétés photothermiques permettant de chauffer fortement et très loca- lement et d’induire ainsi la nécrose de tissus biologiques [1–4, 6]. Depuis peu, l’utilisation d’auto-assemblages de nanoparticules reliées par de l’ADN [188, 189] ou d’agrégats de na- noparticules contrôlés par le pH se développe pour la détection et l’élimination des cellules cancéreuses [190]. En effet, une fois les cellules cancéreuses éliminées, le désassemblage de telles structures en nanoparticules individuelles de faible diamètre, permet une meilleure élimination de celles-ci par l’organisme [188].
La connaissance de l’évolution structurale de groupements auto-assemblés lors d’un échauffement est donc primordiale pour pouvoir effectuer des études in vivo. Dans ce contexte, nous allons utiliser le cas canonique de dimères assemblés par ADN et étudier optiquement leur morphologie en fonction de la température locale.
6.1.1
Protocole expérimental.
Nous effectuons des mesures de spectres de diffusion de dimères de nanoparticules de 60 nm de diamètre dont la synthèse a été décrite dans le chapitre 3. Nous avons choisi cette taille de particules afin que les dimères diffusent suffisamment pour être étudiés aisément à l’aide d’un objectif à air (x 60, N A = 0, 7) et d’un condenseur à air (N A ∈ [0, 8 − 0, 92]). En effet, l’huile d’immersion utilisée dans les chapitres précédents présente l’inconvénient d’avoir des propriétés physico-chimiques qui varient avec l’augmentation de température, ce qui peut nuire aux mesures expérimentales.
L’augmentation de température est effectuée de deux manières. D’une part, l’échantillon est placé sur un module Peltier circulaire, contrôlé par un générateur de tension, permet- tant d’élever la température à l’intérieur de la chambre jusqu’à 45oC. Pour atteindre des températures supérieures (jusqu’à 65oC), nous retirons le filtre froid placé devant la lampe
6.1. Influence d’autres stimuli extérieurs : cas particulier de la température 139
de la goutte, permet de relever la température locale, comme montré sur la figure 6.1.
Nous étudions ici deux chimies de surface différentes : E6m et A11E6c. De même que dans les chapitres précédents, les chimies de surface des deux billes d’un dimère sont légèrement différentes l’une de l’autre pour permettre l’accrochage à la surface du substrat d’une seule des billes. L’autre est en suspension dans une solution tampon. Les échafaudages d’ADN utilisés pour chacune des deux chimies de surface sont très proches et sont constitués d’une tige-boucle fermée. Les tailles des tiges sont détaillées dans le tableau 6.1.
L’incubation des dimères dans la chambre microfluidique permettant leur accrochage est effectuée à 10 mM (resp. 100 mM) en NaCl pour les dimères en E6m (resp. A11E6m). La chambre est ensuite rincée avec 200 µL de T5 (resp. T100). Ces valeurs de concen- tration saline sont faibles compte tenu des chimies de surface utilisées et empêchent une éventuelle agrégation des dimères due à une force ionique trop élevée.
Table 6.1 – Tableau récapitulatif pour chacune des chimies de surface étudiées, de la longueur (en paire de bases) de la tige d’ADN, de sa température de fusion TF, des nombres (Nb)
de dimères mesurés et utilisés dans l’analyse ainsi que le pourcentage correspondant et de la pureté des échantillons (pourcentage de dimères).
Ligand Tige TF (oC) Nb Mesurés Nb utilisés % correspondant Pureté (%)
E6m 6 40 80 64 80 85
A11E6c 15 60 34 20 58 45
Figure 6.1 – a) Photographie d’une chambre microfluidique possédant un thermocouple. b) Image en champ sombre d’une chambre contenant des dimères de particules de 60 nm recouvertes de E6m (barre d’échelle = 10 µm). c) Évolution d’un spectre de diffusion d’un dimère de particules de 60 nm de diamètre recouvertes du ligand E6m en fonction de la température.
Le protocole de mesure se divise en deux cycles thermiques pour un total de neuf mesures des spectres de diffusion des dimères :
- Premier cycle : On augmente la température jusqu’à 35oC, avec un palier à environ 30oC, avant de l’abaisser jusqu’à température ambiante. Les mesures sont prises 10
- Deuxième cycle : On augmente la température jusqu’à 65oC, avec des mesures des
spectres de diffusion tous les 10oC environ. Finalement, on abaisse la température et une dernière mesure est effectuée à température ambiante.
Les nombres de dimères mesurés initialement et utilisés dans l’analyse, ainsi que la pureté des échantillons obtenue à partir des images de la caméra CCD couleur, sont fournis dans la tableau 6.1. On remarque que les échantillons des dimères recouverts du ligand E6m sont d’une très grande pureté (85% de dimères) et que ceux-ci sont très stables à faible force ionique. En effet, 80% des dimères mesurés sont conservés dans l’étude et parmi les inutilisés, 10% ne sont pas ajustables par une lorentzienne et 10% se détachent en ne laissant qu’un monomère.
La pureté des échantillons de dimères recouverts d’alkyle-PEG est beaucoup plus faible (45%), ce qui peut provenir du fait que les dimères aient été conservés à faible force ionique après leur synthèse, induisant ainsi une répulsion entre les particules des dimères pouvant entraîner une rupture de la liaison entre les groupements thiols et l’or. De plus, de nombreux dimères (30%) se sont décrochés du substrat lors de l’expérience, témoignant des fortes répulsions entre le substrat et les particules recouvertes du ligand alkyle-PEG.