de protéines [114,115], d’ions métalliques [116,117], pour la spectroscopie Raman [118,119] et finalement pour exalter l’émission de fluorescence [120, 121].
Des études se sont aussi concentrées sur l’accrochage d’un nombre limité de brins d’ADN. Cela a été mis en évidence par des gels d’électrophorèse [19] et a permis la fabrication d’auto-assemblages contrôlés grâce à la reconnaissance de brins d’ADN com- plémentaires [99].
Il faut noter qu’une difficulté dans l’optimisation de ces protocoles d’auto-assemblage est l’interaction non spécifique entre les brins d’ADN et les particules. En effet, l’adsorption d’ADN sur des nanoparticules a déjà été mis en évidence avec de l’ADN simple brin par interaction hydrophobe entre la surface de l’or et les bases de l’ADN [122] mais aussi avec un large excès d’ADN double brin [123].
En conclusion, nous avons vu que la programmabilité de l’ADN permettait d’envisager un éventail de structures possibles. En combinant la sensibilité des groupements de nano- particules d’or à leur morphologie avec le dynamisme structurel de l’ADN, il est possible de concevoir des structures dynamiques sensibles à leur environnement chimique et donc des capteurs optiques.
1.6
Biocapteurs optiques
Nous allons dans cette dernière partie décrire brièvement les principaux biocapteurs optiques basés sur la résonance plasmon afin de comprendre leurs performances et leurs limitations. Nous nous intéresserons particulièrement à la résonance plasmon de surface localisé (LSPR) et ses derniers développements permettant la détection de molécules uniques. Nous décrirons aussi les capteurs colorimétriques basés sur le couplage plasmon. Dans le début des années 1980, les premières démonstrations de l’utilisation de la réso- nance de surface plasmon pour l’étude de processus chimiques à la surface de métaux [124] et la détection de gaz [125] donnèrent naissance aux capteurs à résonance plasmon de sur- face (SPR). Cette technique commerciale (GE Healthcare notamment) permet de suivre et de quantifier les propriétés cinétiques et thermodynamiques des interactions antigènes- anticorps. Toutefois, la SPR est peu répandue dans les essais cliniques [126] de part sa sensibilité plus faible que la plupart des tests immunologiques (tels que les tests ELISA) et à cause du contrôle précis nécessaire de la température de l’échantillon considéré. Afin de surmonter ces difficultés, des biocapteurs basés sur la résonance localisée de plasmon de surface (LSPR) ont commencé à émerger.
1.6.1
LSPR : résonance surface plasmon localisée
Nous avons vu que la forme des spectres d’extinction et de diffusion d’une nanopar- ticule métallique, et en particulier sa longueur d’onde de résonance, dépendaient de la composition de la particule, de sa taille, de son orientation et de l’indice diélectrique en- vironnant [52, 127]. Cela a permis de les utiliser comme agents de contraste brillants et colorés en microscopie optique [114, 128, 129] et dans l’imagerie cellulaire [130, 131]. La plupart des molécules organiques possèdent un indice de réfraction plus grand que la solution tampon dans laquelle elles se trouvent. Lorsqu’elles s’attachent à la nanoparticule,
elles décalent vers le rouge les spectres d’extinction et d’absorption, comme schématisé sur la figure 1.14a-b. L’accrochage d’une molécule peut être suivi en temps réel et en suspen- sion en utilisant un simple spectromètre en transmission qui mesure l’extinction [132,133], ou sur une particule unique [8, 9].
Figure 1.14 – Principe de fonctionnement d’un capteur LSPR à l’échelle de la particule unique. a) Variation de l’indice de réfraction d’une nanoparticule unique par adsorption de protéines à sa surface. b) Évolution de la fréquence de résonance plasmon associée à l’adsorption. c) Schéma d’un montage expérimental en champ sombre de spec- troscopie LSPR permettant la détection de molécules uniques. d) Décalage spectral induit par l’accrochage d’une protéine sur la nanoparticule d’or (extraits de : a-b [9], c-d [11]).
Deux groupes ont récemment réussi à démontrer la possibilité de détecter des molécules uniques, non labélisées, en utilisant deux approches différentes de la spectroscopie LSPR.
Par spectroscopie en champ sombre [11]. Le montage expérimental, schématisé sur la figure 1.14c, est constitué d’un laser en lumière blanche qui éclaire un nanobâtonnet d’or en réflexion totale interne. Le microscope ne récupère alors que la lumière diffusée par la particule et des spectres de la particule sont obtenus en quelques millisecondes. A l’aide de ce dispositif, les auteurs ont pu détecter des protéines de 450 kDa en mesurant des décalages spectraux inférieurs à 0,3 nm (figure 1.14c).
Par imagerie photothermique [10]. Pour effectuer de l’imagerie photothermique, un faisceau laser pompe modulé est utilisé pour chauffer les nanoparticules, et un faisceau sonde est utilisé pour détecter la déflection induite par le changement d’indice de réfrac- tion causé par l’élévation de température. L’accrochage de protéines de 150 kDa a pu être détecté en utilisant cette technique.
Finalement, malgré les performances de ces dispositifs, ils restent d’une grande com- plexité et les signaux obtenus sont très faibles. Afin, d’obtenir des décalages spectraux plus larges, des équipes ont développé des capteurs basés sur les couplage plasmon : les capteurs colorimétriques.
1.6. Biocapteurs optiques 29
1.6.2
Capteurs colorimétriques
Les premiers capteurs colorimétriques ont été développés par le groupe de Chad Mirkin en 1997 [13, 14] et se basent sur le couplage plasmon entre des particules proches. Le principe est schématisé sur la figure 1.15a. Deux groupes de nanoparticules sont fonction- nalisés avec des brins d’ADN non complémentaires (notés a et b sur la figure). En les hybridant avec des brins d’ADN complémentaires à chacune des séquences (notés a’b’), il se forme un complexe macroscopique d’or-ADN. Un changement de couleur du rouge au bleu est alors observé (figure 1.15b), conséquence du couplage plasmon entre les particules inorganiques assemblées. Cette technique est très sensible à la structure de l’ADN cible et permet notamment de déterminer des modifications d’une seule base de la séquence cible.
Figure 1.15 – a) Schéma du principe du capteur colorimétrique. b) Changement de couleur relatif à l’hybridation des brins a et b avec a’b’ et à la formation d’un agrégat macroscopique (adapté de [13,14]). c) Performance d’un test ELISA plasmonique basé sur la synthèse de nanoparticules en fonction de la concentration en molécule cible de H2O2 (extrait
de [134]). d) Performance d’un capteur colorimétrique basé sur le décalage spectral induit par la croissance d’une couche d’argent, contrôlée catalytiquement, sur un nanocristal d’or (extrait de [135]).
Cette technologie a donné lieu à de nombreuses études, notamment sur la possibilité de modifier réversiblement l’état de la structure. Ceci a pu être réalisé par des changements de pH [136], par l’addition de courtes séquences d’oligonucléotides [137] et par l’utilisation de séquences aptamères [138]. La principale limitation de cette technique réside dans la nécessité d’avoir une grande quantité de réactifs cibles pour la mesure d’une réponse optique macroscopique.
Afin d’améliorer la sensibilité de ce type de capteur, des capteurs colorimétriques basés sur la synthèse de nanoparticules catalysée par la présence d’une biomolécule cible ont récemment été développés. Ces "tests ELISA plasmoniques" [134,135] permettent d’obtenir des décalages spectraux visibles à l’œil nu pour des quantités très faibles d’analytes cibles (figure 1.15c). Toutefois, les réactions étant catalytiques, elles sont fortement non-linéaires et des effets de seuil peuvent se produire, limitant leur utilisation quantitative, avec des cinétiques très faibles à basse concentration en analyte.