2.4.1
Réversibilité et sensibilité
Nous avons vu précédemment que l’électrophorèse permettait de visualiser la topologie (ouverte ou fermée) des dimères purifiés. Elle peut donc être aisément utilisée pour tester l’efficacité et la réversibilité de l’ouverture et de la fermeture de la boucle d’ADN. La spectroscopie de résonance plasmon n’est pas applicable dans ce cas car les distances interparticules pour les structures 4 et 5 sont supérieures au rayon des particules, ce qui donnerait un couplage plasmon négligeable [20, 23, 68].
Après incubation des structures 4 et 5 avec différents excès de T et T’ respectivement (allant de x 4 à x 400 par rapport au nombre de dimères) pendant une durée de 30 minutes, à température ambiante et à 80 mM en NaCl, nous caractérisons nos structures en électrophorèse.
Le gel correspondant est montré sur la figure 2.9a. On remarque des bandes uniques pour tous les échantillons, démontrant que l’ouverture et la fermeture de la boucle d’ADN n’altèrent pas les dimères préalablement synthétisés. De plus, la mobilité électrophorétique des échantillons obtenus se situe entre celles des structures de référence 4 et 5, indiquées par des flèches sur le côté du gel (les colonnes 1 et 5 correspondant respectivement aux échantillons 5 et 4).
La figure 2.9b fournit la section efficace verticale pour les échantillons 5 (trait plein noir), 5+400*T’ (trait pointillé noir), 4 (trait plein rouge) et 4+400*T (trait pointillé
2.4. Étude de la structure dynamique 51
Figure 2.9 – a) Gel d’électrophorèse de dimères dynamiques de particules de 8 nm formés après incubation (30 minutes, température ambiante, 80 mM NaCl) avec différents excès de brins d’ADN T et T’ par rapport au nombre de dimères. La valeur des excès est mentionnée sur la figure pour chacune des colonnes. Les flèches sur le côté indique la position des échantillons de référence 4 et 5. b-e) Densité optique en fonction de la position des dimères sur l’axe de migration pour les huit colonnes de a), les courbes suivant le code de couleur défini en a).
rouge). Les pics correspondants à 4 et 5 sont presque superposés avec 5+400*T’ et 4+400*T respectivement, indiquant que le réaction est complète et réversible dans les deux sens.
En réduisant l’excès d’ADN cible, nous observons que la fermeture de la boucle est plus favorable que l’ouverture. La figure 2.9c montre les mobilités électrophorétique des échantillons 5, 5+4*T’ (trait pointillé vert), 5+40*T’ (trait plein vert) et 5+400*T’. Tandis que la réaction est totale pour 5+40*T’, la courbe correspondant à 5+4*T’ présente un pic plus large compatible avec une somme pondérée des pics correspondant à 4 et 5. Ce résultat indique une population mixte de dimères fermés et ouverts.
Pour confirmer cette hypothèse, nous avons mélangé des quantités égales de 4 et 5 avant de faire une analyse en électrophorèse. Nous n’avons alors observé qu’une bande unique, même pour des temps de migration plus longs, suggérant que la différence de mobilité électrophorétique entre les dimères ouverts et fermés est au-delà du pouvoir de séparation de l’électrophorèse dans ces conditions expérimentales (données non présentées).
L’étude de la réaction d’ouverture de la boucle des dimères fermés dans les mêmes conditions expérimentales fournit des résultats significativement différents, présentés sur la figure 2.9d. En effet, l’échantillon 4+4*T (trait pointillé bleu) est quasiment superposé à la référence 4 tandis que 4+40*T (trait plein bleu) est un mélange de dimères ouverts et fermés. L’asymétrie de la réactivité est plus évidente sur la figure 2.9e sur laquelle les échantillons 5+4*T’ et 4+40*T possèdent des mobilités équivalentes, bien qu’il ait fallu un excès dix fois plus important de l’ADN cible pour ouvrir la boucle. Ce phénomène est probablement dû à la gêne stérique dans les dimères fermés lorsque le brin T doit se rapprocher du centre des particules alors que celles-ci sont proches, entraînant une augmentation de l’énergie d’activation.
2.4.2
Reproductibilité
Nous venons de démontrer la possibilité d’ouvrir et de fermer la boucle tout en évaluant la sensibilité de chacune des réactions. Cette partie a pour but de démontrer la repro- ductibilité de chacune des réactions. Pour cela, l’ouverture et la fermeture réversibles de la boucle (passage de 4 à 5, et de 5 à 4) ont chacune été effectuée trois fois de suite dans des conditions expérimentales différentes, confirmant encore une fois la robustesse du procédé.
Première étape. Les suspensions purifiées de 4 et 5 sont mélangées avec un excès de T et T’ (x 400 par rapport aux nombre de dimères) à 80 mM en NaCl. Elles sont chauffées à 50◦C puis laissées à refroidir lentement pendant une nuit. Une partie des échantillons 4 et 5 est gardée préalablement et utilisée comme référence. Le gel électrophorétique correspondant est présenté sur la figure 2.10a-i.
Une coupe transverse de l’image est donnée sur la figure 2.10a-ii. La référence 5 (trait plein noir) est superposée avec 4+400*T (trait pointillé rouge) et la référence 4 (trait plein rouge) est superposée avec 5+400*T’ signifiant que la réaction a effectivement eu lieu et est totale dans les deux sens.
2.4. Étude de la structure dynamique 53
Figure 2.10 – Gel d’électrophorèse (i) et profils densitométriques correpondants (ii) de dimères dy- namiques de particules de 8 nm incubés avec un excès du brin d’ADN cible (x 400 par rapport au nombre de dimères). Le temps de réaction est d’une nuit pour (a-b) et d’une heure pour (c). La température de réaction est fixée à 50oC pour (a) et à température ambiante pour (b-c).
Deuxième étape. Après extraction des dimères du gel précédent, 5 et 4+400*T sont mélangés ensemble (devenant simplement 5) et 4 et 5+400*T’ également (devenant simplement 4). La moitié de ces échantillons est gardée comme référence tandis que la seconde moitié est incubée pendant une nuit à température ambiante, avec un excès (x 400) de l’ADN cible (T pour 4 et T’ pour 5) à 80 mM en NaCl.
La purification électrophorétique de ces échantillons (figure 2.10 b-i) fournit des résultats similaires à ceux obtenus lors de la première étape, effectuée dans les mêmes conditions mais avec un traitement thermique en plus. Les coupes transverses de l’image du gel correspondant sont données sur la figure 2.10b-ii et indiquent que 5 (trait plein noir) est superposé avec 4+400*T (trait pointillé rouge) et 4 (trait plein rouge) est superposé avec 5+400*T’ (trait pointillé noir).
Troisième étape. Une fois de plus, après extraction des dimères du gel précédent, 5 et 4+400*T sont mélangés ensemble (devenant 5) et 4 et 5+400*T’ également (devenant 4). Du fait du rendement limité de l’extraction après électrophorèse à chaque étape, on ne peut pas constituer de références pour cette dernière étape. 4 et 5 sont incubés à température ambiante pendant une heure avec un excès (x 400) de T et T’ respectivement, à 80 mM en NaCl avant l’analyse électrophorétique (figure 2.10c-i).
Les coupes transverses de la figure 2.10c-ii montrent que 4+400*T (trait plein noir) a une mobilité électrophorétique plus faible que 5+400*T’, démontrant une fois de plus que la réaction a effectivement eu lieu dans ces conditions expérimentales, pour la troisième
fois consécutive. Les données présentées dans les sections précédentes du manuscrit ont été obtenues dans les mêmes conditions mais avec un temps d’incubation plus faible, suggérant que les réactions de cette étape sont également totales.