Partie III Résultats : application à trois projets de recherche
CHAPITRE 2 Recherche de biomarqueurs de cellules souches cancéreuses
C. Stratégie analytique mise en place
Dans un premier temps, nous nous sommes basés sur la stratégie mise en place pour le projet d’identification de potentiels biomarqueurs candidats des lymphomes à cellules B (cf. figure 131).
Figure 131
Stratégie mise en place pour la recherche de biomarqueurs candidats à visée diagnostique dans le cas des lymphomes B
Cependant, cette stratégie a nécessité quelques adaptations pour différentes raisons :
L’étude a porté ici sur des microparticules plasmatiques circulantes (MPCs) et non plus des microparticules induites (MPIs) directement à partir de lymphocytes malins. En effet, les MPIs nécessitent une mise en culture des cellules malignes, stratégie peu envisageable pour l’analyse de 120 patients.
Une semaine était nécessaire à l’analyse d’un échantillon. Cette durée est incompatible avec un grand nombre d’échantillons.
Un nouvel instrument de type Q-TOF (Maxis Impact, Bruker Daltonics), caractérisé par une vitesse d’acquisition accrue, une meilleure sensibilité, une haute résolution ainsi qu’une précision de masse élevée, a été acquis par le laboratoire.
C.1. Les microparticules circulantes
Les MPCs ont été étudiées dans le chapitre 1 de la Partie II. Ainsi, nous avons montré :
la possibilité de détecter des MPCs d’origine leucocytaire dans les échantillons malgré le nombre important de MPCs d’origine plaquettaire ;
la répétabilité de la collecte en termes de nombre de MPCs obtenues ;
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C.2. Évaluation du nouvel instrument Q-TOF
Les performances du nouveau Q-TOF ont été évaluées dans le chapitre 4 de la Partie II. Ainsi, nous avons démontré :
la linéarité de réponse de l’appareil ;
la répétabilité de la quantification des protéines sur 12 injections du même échantillon avec
extraction des courants d’ions par le logiciel Skyline (coefficient de variation médian de 14 % et moyen de 18 %).
C.3. Évaluation du degré de séparation nécessaire pour l’analyse des MPCs
Plusieurs types de séparation de l’échantillon ont été testés. La question sous-jacente était de déterminer s’il était possible de réduire le fractionnement en 90 bandes sur gel de l’échantillon grâce à l’efficacité du nouvel appareil de spectrométrie de masse.Comme discuté précédemment dans le chapitre 1 de la Partie III, le SDS reste le détergent le plus efficace pour la solubilisation des protéines. Dans cette optique, nous avons testé trois types de séparation sur gel :
Gel 2 bandes
Gel 6 bandes
Gel 15 bandes
Le protocole de test est illustré par la figure 132. 6 échantillons de MPCs ont été mélangés puis redivisés en 6. Chaque aliquot a été déposé deux fois sur des gels différents pour chacune des trois séparations. Après réduction, alkylation et digestion des protéines, les mélanges peptidiques obtenus ont été injectés deux fois pour chaque préparation sur le Maxis Impact.
Le gradient a été adapté à chaque séparation dans le but de réaliser un maximum d’identifications dans un temps d’analyse raisonnable :
60 min de gradient pour chacune des bandes du gel 15 bandes (soit 15 h d’analyse par échantillon)
90 min pour le gel 6 bandes (soit 9 h d’analyse par échantillon)
120 min pour le gel 2 bandes (soit 4 h d’analyse par échantillon)
Pour chacune des 12 injections réalisées, nous avons obtenu une liste de protéines identifiées via le moteur de recherche Mascot et quantifiées via l’extraction des courants d’ions par Skyline.
Partie III Chapitre 3 : Recherche de biomarqueurs prédictifs des rechutes du système nerveux central
▐ 182 Figure 132
Test de différents types de séparation sur gel d'un même échantillon de MPCs
Pour chaque technique, les MPCs ont été déposées deux fois et chaque réplicat technique a été injecté deux fois sur le Maxis Impact.
Les résultats ont été évalués sur la base de deux critères :
le nombre de protéines identifiées (FDR < 1 %) ;
la répétabilité de la quantification.
La figure 133 montre le nombre de protéines identifiées pour chaque séparation. En moyenne, le gel 6 bandes permet de réaliser 34 % d’identifications supplémentaires par rapport au gel 15 bandes et 50 % par rapport au gel 2 bandes. L’augmentation de la séparation de 2 à 6 bandes a donc un fort impact sur le nombre de protéines détectées. Par contre, la séparation à 15 bandes est moins efficace. Ceci peut s’expliquer par la réduction du temps de gradient.
La séparation 6 bandes est ici la plus efficace en termes d’identifications. L’exploitation du gel 15 bandes ne sera pas poursuivie. En effet, il apparaît peu judicieux d’utiliser cette séparation dans le sens où le nombre d’identifications n’augmente pas alors que le temps d’analyse est supérieur à celui du gel 6 bandes.
Chapitre 3 : Recherche de biomarqueurs prédictifs des rechutes du système nerveux central Partie III
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Figure 133
Nombre de protéines identifiées suivant la séparation sur le gel 1D SDS PAGE (15, 6 et 2 bandes), le réplicat de préparation et le réplicat d'injection
Dans un deuxième temps, nous avons évalué la reproductibilité de la quantification. La figure 134 présente la répartition des coefficients de variation de l’intensité de quantification obtenus pour chaque protéine sous forme de boîtes à moustaches. La médiane et la moyenne des coefficients de variation pour le gel 2 bandes sont quasiment deux fois plus faibles que celles du gel 6 bandes. Ceci est dû à l’amélioration de la séparation qui permet l’identification de protéines moins abondantes et donc plus difficilement quantifiables.
La séparation sur gel 6 bandes induit des questions et des difficultés supplémentaires : sera-t-elle reproductible pour une centaine d’échantillons ? Ces derniers seront-ils comparables ? Comment combiner les résultats des extractions d’ions pour une protéine identifiée dans plusieurs bandes ? Sans oublier que le temps d’analyse est multiplié par deux.
Finalement, au vu de toutes ces considérations, afin de simplifier l’analyse et l’interprétation des résultats et de limiter au maximum le temps passé à analyser chaque échantillon, nous avons opté pour le gel 2 bandes. 883 951 1378 1507 677 715 768 910 1156 1263 647 647 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 15 bandes prep 1 15 bandes prep 2 6 bandes prep 1 6 bandes prep 2 2 bandes prep 1 2 bandes prep 2 N o m b re d e p ro té in e s Préparation de l'échantillon Inj 1 Inj 2
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▐ 184 Figure 134
Boîtes à moustaches des coefficients de variation de la quantité de chaque protéine obtenue à la suite d'une séparation sur gel 6 bandes et gel 2 bandes
Remarque complémentaire : il a été envisagé de ne découper qu’une bande sur le gel, à l’image de ce qui a été réalisé pour le projet de quantification par SRM des marqueurs de lymphomes B (cf. Partie III – chapitre 1). Cependant, les MPCs sont contaminées par des protéines plasmatiques en forte abondance et notamment par des protéines de haut poids moléculaire, telles que l’apolipoprotéine B100 (515 kDa), ou la filamine A (280 kDa), qui occasionnent une forte diminution de signal et donc du nombre de protéines identifiées.
C.4. Stratégie protéomique mise en place
La stratégie protéomique mise en place pour l’analyse des 125 échantillons de MPCs est présentée en figure 135. Une fois décongelés, les échantillons de plasma sont centrifugés 2 min à 18 000 g afin d’obtenir des plasmas pauvres en plaquettes. Une centrifugation à 18 000 g pendant 45 min permet l’obtention de culots de MPCs qui sont ensuite lavés deux fois au PBS. Les microparticules sont ensuite reprises dans du tampon Laemmli et migrées pendant 45 min à 50 V dans un gel de concentration à 4 %. Deux bandes sont découpées puis les protéines sont réduites et alkylées. À ce stade, les échantillons sont stockés à - 20 °C. 26 gels 1D SDS PAGE ont ainsi été réalisés.
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Les protéines ont été digérées et après extraction, des iRTs (mélange de 11 peptides standard commercialisés par la société Biognosys) ont été ajoutés dans le mélange de peptides avant injection sur le couplage nanoLC-MS/MS (Maxis Impact, Bruker Daltonics). Puis, les identifications ont été réalisées par recherche dans les banques de données avec un FDR < 1 %. Les courants d’ions ont été extraits via Skyline afin d’associer une donnée de quantification à chaque protéine.
Figure 135
Schéma d'injection finale des 125 échantillons de MPCs collectés sur 125 patients atteints d'un LDGCB
Remarque 1 : les 125 échantillons ont nécessité quatre semaines d’analyse sur le couplage. Afin d’éviter une dégradation des mélanges peptidiques, 32 échantillons ont été digérés par semaine.
Remarque 2 : au vu du nombre d’échantillons, il n’a pas été possible d’envisager de réplicats techniques. Dans cette manipulation, seules les différences entre réplicats biologiques seront évaluées.