Partie II Développement de méthodes d’analyse
CHAPITRE 2 Développement de méthodes nanoLC-MS/MS pour l’analyse de
C. Utilisation d’un nouveau mode d’acquisition : la DIA
C.3. Intérêt de l’utilisation combinée du mode DIA et de la mobilité ionique
DIA-mobilité ionique, appelée HD-MSE, un digestat d’E-Coli (MassPREPTM digestion standard mix 1, Waters) a été injecté suivant les trois modes d’acquisition possibles : DDA, MSE et LC-HDMSE. La DDA a été réalisée sur le Synapt G1 car les méthodes d’acquisition y sont déjà opérationnelles et optimisées.
Chapitre 2 : développement de méthodes nanoLC-MS/MS Partie II
91 ▐
Figure 63
Nombre d'identifications protéiques (A) et peptidiques (B) obtenues lors d'acquisition en mode DDA, MSE et HDMSE
La figure 63 présente un gain en identifications au niveau protéique et peptidique avec la MSE et, surtout, la LC-HDMSE par rapport à une acquisition DDA classique. Cette expérience montre l’efficacité de la MSE et de la LC-HDMSE pour obtenir la couverture du protéome d’un échantillon plus large.
Deux raisons principales expliquent ce résultat :
La fragmentation de l’ensemble des précurseurs en mode MSE n’occasionne pas de perte d’informations.
La mobilité ionique en HDMSE facilite l’association des fragments aux précurseurs en créant une dimension de séparation supplémentaire.
Par ailleurs, la répétabilité des injections a été évaluée aux niveaux peptidique et protéique (cf. tableau 6). Les résultats ne montrent pas une amélioration de la répétabilité des analyses par rapport à la DDA. La MSE montre même des performances largement inférieures, notamment au niveau peptidique. Cela peut-être imputé au logiciel PLGSTM. En effet, le traitement des données est réalisé de manière itérative de façon à assigner le maximum de spectres, indépendamment de la qualité de ces derniers.
Technique utilisée % Protéines % Peptides
DDA 73 54
MSE 61 28
LC-HDMSE 74 61
Tableau 6
Pourcentage d’identifications protéiques et peptidiques communes pour trois injections du digestat d’E.Coli
Ainsi, si le mode d’acquisition DIA ne permet pas d’améliorer la répétabilité des analyses, il permet néanmoins d’en augmenter la profondeur. Cependant, ces bons résultats sont à pondérer par la qualité des spectres. En effet, le logiciel PLGSTM autorise l’assignation de spectres MS/MS de qualité douteuse sous couvert du respect des 14 critères (ou 15 si utilisation de la mobilité ionique) et du taux de FDR (< 1 %).
La figure 64 montre quelques spectres obtenus et validés par PLGS lors d’une analyse LC-HDMSE avec les pepscores assignés. Une analyse qualitative des spectres a montré qu’en dessous d’un score de 8, la
Partie II Chapitre 2 : développement de méthodes nanoLC-MS/MS
▐ 92
qualité est discutable. Or, d’après la figure 65, la majorité des spectres validés sont identifiés avec un pepscore entre 6 et 7. Pour les peptides decoy (random), les pepscores maxima sont compris entre 5 et 6. Ainsi, si la qualité des spectres reste discutable, très peu de decoys sont identifiés avec un score supérieur à 6, ce qui justifie la pertinence des 15 critères.
Figure 64
Chapitre 2 : développement de méthodes nanoLC-MS/MS Partie II
93 ▐
Figure 65
Nombre de peptides identifiés suivant les plages de score en MSE et LC-HDMSE et nombre de peptides decoy
(random) identifiés suivant les mêmes plages de scores
Une question importante est ici soulevée : quelle confiance peut-on accorder à PLGSTM pour les identifications ainsi qu’à des critères issus de modèles basés sur les propriétés physico-chimiques des peptides, et non plus uniquement sur la qualité des spectres ?
D’autre part, si la LC-HDMSE apporte une dimension de séparation supplémentaire, elle occasionne aussi une réduction de la gamme dynamique pour deux raisons220, 221 :
La perte par diffusion lors de la séparation des ions dans la cellule de mobilité : en effet, les
ions passent de la cellule Trap à basse pression (5.10-2 mbar) à la cellule d’IMS où règne une haute pression (0,5 mbar) et à la cellule Transfer où la pression redevient basse (5.10-2 mbar).
La saturation du digitaliseur : les ions ne sont plus distribués de manière équitable entre les 200 cycles TOF mais sont enregistrés sur un faible nombre de cycles.
Ces deux effets sont décrits dans la figure 66. L’intensité du BPI est largement moins élevée dans le cadre d’une acquisition utilisant la mobilité ionique et un effet de saturation est observé sur les ions les plus intenses. Le massif isotopique a la « tête coupée », ce qui occasionne un changement des rapports isotopiques. Par ailleurs, on observe un phénomène de résonance du digitaliseur.
0 5 10 15 20 25 30 35 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 > 9 N o m b re d e p e p tide s de coy N o m b re d e p e p tide s Pepscore
Partie II Chapitre 2 : développement de méthodes nanoLC-MS/MS
▐ 94 Figure 66
BPI obtenus lors d'acquisitions utilisant la LC-HDMSE et la MSE
L’intensité globale du BPI est moins importante dans le cas d’une acquisition utilisant la mobilité. Un phénomène de saturation est observé sur les ions les plus intenses (résonance du digitaliseur et modification des rapports
Chapitre 2 : développement de méthodes nanoLC-MS/MS Partie II
95 ▐
C.4. Conclusions
La MSE permet d’augmenter la profondeur de l’analyse des échantillons. Cependant, la difficulté reste l’identification et la validation des spectres. Pour le moment, il n’existe qu’un seul logiciel commercial interprétant ces données et l’assignation de certains spectres reste discutable. Si la mobilité ionique permet, quant à elle, d’améliorer la qualité des assignations, elle réduit aussi la gamme dynamique. Des développements méthodologiques restent à apporter à cette technique, tant au niveau instrumental que logiciel. Il y a fort à parier que ce mode d’acquisition remplacera un jour la DDA, comme en témoignent les publications récentes parues dans des journaux à facteur d’impact élevé 220-224
.
D. Conclusion générale
Ce chapitre illustre les limitations du mode d’acquisition DDA : le protéome complet d’un échantillon ne peut être identifié à l’issue d’une seule analyse. C’est pourquoi il est important de réaliser une optimisation fine de la séparation chromatographique et des paramètres d’acquisition du spectromètre de masse afin d’obtenir la vision la plus significative possible d’un échantillon. De plus, il a été démontré qu’une deuxième injection permettait, quel que soit l’instrument utilisé, d’apporter de nouvelles identifications protéiques et peptidiques. Dans ce contexte, la répétition avec liste d’exclusion s’est avérée très efficace.
L’avenir de l’analyse haut débit semble ici se diriger vers le développement de nouveaux modes d’acquisition DIA. Cependant, si le concept de la LC-HDMSE est prometteur (possibilité d’identifier et de quantifier le protéome complet d’un échantillon), quelques points techniques restent à améliorer, notamment au niveau du logiciel permettant de valider les spectres identifiés.
Partie II Chapitre 2 : développement de méthodes nanoLC-MS/MS