Développements méthodologiques

La culture de cellules souches cancéreuses est un travail long et difficile. Le nombre d’échantillons issus de patients différents à disposition est par conséquent peu élevé (4 GSCs). En outre, les protéines membranaires (RCPGs et CDs) sont faiblement abondantes. Dans ce contexte, la stratégie mise en œuvre a été optimisée de manière à obtenir une vision du protéome membranaire de chaque échantillon la plus complète et la plus fiable possible.

Les apports des développements méthodologiques sont ici décrits de manière succincte. Pour plus de détails se reporter à la Partie II.

B.3.1. Enrichissement des échantillons en protéines membranaires par la génération de

ghosts

De la même manière que pour le projet « lymphome » précédemment décrit, nous avons choisi de travailler sur les protéines membranaires. En effet, celles-ci sont des cibles thérapeutiques privilégiées dans le cadre des cancers.

Comme il n’a pas été possible de générer des microparticules induites à partir des GCSs, nous nous sommes orientés vers une lyse mécanique des cellules conduisant à la formation de ghosts membranaires. En moyenne, un enrichissement de 24 % a été observé dans chaque échantillon, valeur couramment relevée dans la littérature.

B.3.2. Optimisation fine des paramètres de chromatographie liquide et d’acquisition du couplage

Les analyses ont été réalisées sur le couplage nanoLC-Chip (Agilent) – trappe ionique AmaZon (Bruker Daltonics). Les paramètres clés de ce dernier ont été finement étudiés et optimisés afin d’extraire d’un échantillon le maximum d’informations possibles :

 Temps de gradient : il s’agissait ici de déterminer le temps de gradient optimal de façon à séparer au maximum les peptides pour faciliter leur sélection, tout en conservant un temps

Partie III Chapitre 2 : Recherche de biomarqueurs de cellules souches cancéreuses de glioblastomes

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d’analyse correct. Finalement, un gradient de 61 min de 2 à 40 % en ACN comportant deux pentes a été choisi.

 _{Nombre d’ions sélectionnés pour la MS/MS : des sélections de 6, 8 et 10 ions pour la MS/MS}

ont été testées. Aucun changement dans les résultats obtenus n’a été observé. De manière arbitraire, le paramètre 8 ions a été choisi.

 _{Balayage des ions : sur la trappe ionique, il est possible de paramétrer la vitesse de balayage}

des ions suivant quatre modes. Cependant, si une vitesse élevée permet de gagner en sensibilité et en nombre de spectres réalisés, elle entraîne une perte de résolution. Les tests nous ont permis de montrer que le mode UltraScan, 32 500 (m/z)/s, était le plus pertinent à utiliser pour l’acquisition MS/MS. En effet, le nombre d’identifications était augmenté. À noter qu’il s’agit du mode de balayage le plus rapide lors de l’acquisition en DDA.

 Accumulation des ions dans la trappe ionique : il a été observé qu’une augmentation du nombre d’ions accumulés (ICC = 400 000) dans la trappe ionique lors de l’acquisition MS/MS permettait d’augmenter le nombre d’identifications.

 Le seuil de sélection absolu des ions a été évalué en fonction du bruit de fond.

L’optimisation fine de chacun de ces paramètres a permis d’augmenter de manière significative les performances instrumentales quant au nombre de protéines identifiées.

B.3.3. Recherche dans les banques de données

Les paramètres du moteur de recherche Mascot ont été étudiés afin d’être adaptés à notre analyse, c’est-à-dire aux types d’échantillons et à l’appareil utilisé.

 _{Erreur sur la masse du précurseur : ce paramètre est important dans la mesure où il influe sur}

l’espace de recherche. Or plus l’espace de recherche est grand, plus l’identification de faux positifs sera favorisée. Il a été montré qu’au maximum, l’erreur était de 0,2 Da.

 _{Modifications post-traductionnelles : dans notre cas, les modifications post-traductionnelles}

ont été apportées par le processus de traitement des échantillons. Il est connu que les cystéines sont couramment carbamidométhylées et les méthionines, oxydées. Notre étude a permis de montrer que la propionamidation des cystéines issues de leur réaction avec l’acrylamide non polymérisée concernait un nombre important de peptides de notre échantillon.

 Spécificité de l’enzyme : il a été démontré que très peu de peptides sont semi-trypsiques (4 %) et que la quasi-totalité de ces derniers comporte au maximum une coupure manquée.

Dans un deuxième temps, les résultats obtenus à l’aide du moteur de recherche Omssa ont été comparés à ceux obtenus en utilisant Mascot. De manière surprenante, Omssa identifiait 24 % de protéines supplémentaires. Cette observation s’explique par la présence d’un paramètre dans Omssa qui permet de s’affranchir des problèmes de déconvolution, courant sur les instruments de basse résolution. Afin de maximiser le nombre d’identifications, nous avons choisi de conserver celles des deux moteurs de recherche.

Chapitre 2 : Recherche de biomarqueurs de cellules souches cancéreuses de glioblastomes Partie III

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Comme précédemment, l’étude fine de l’ensemble de ces paramètres de recherche dans les banques de données nous a permis d’augmenter la qualité ainsi que le nombre de protéines identifiées.

B.3.4. Évaluation de la qualité du spectral count

Le spectral count est une technique basée sur le comptage du nombre de spectres afin d’évaluer la quantité d’une protéine présente dans un échantillon donné. Elle est couramment utilisée lors de l’analyse différentielle de divers échantillons. Notre étude a permis de montrer qu’il était pertinent d’utiliser le spectral count sur des résultats issus d’une trappe ionique.

Cependant, deux biais importants ont nécessité une adaptation des étapes développées lors des tests réalisés sur la levure :

 _{Des réplicats d’analyse n’ont pu être réalisés. En effet, le projet nécessitait la comparaison de}

sept échantillons déposés sur un gel 1D (90 bandes) soit une semaine d’analyse par échantillon.

 Des échantillons supplémentaires ont été ajoutés par le collaborateur à la suite de la première série de manipulations (comparaison de résultats issus de deux gels différents).

Ainsi, dans la première série de manipulations, cinq échantillons ont été analysés. Dans la deuxième série, deux échantillons supplémentaires ont été ajoutés. Afin d’évaluer la reproductibilité de nos analyses, et notamment du dépôt sur gel, deux échantillons déposés sur gel lors de la première manipulation ont été redéposés sur le deuxième gel. La figure 118 présente le schéma d’analyse.

Figure 118

Schéma de l'analyse réalisée

La première série d'échantillons a été déposée sur le gel 1 en mai 2012 puis analysée sur la trappe AmaZon. La deuxième série a été déposée en décembre 2012 sur le gel 2 puis analysée sur la trappe AmaZon.

À noter que les échantillons 1 et 3 ont été déposés et analysés deux fois. Les recherches dans les banques de données ont été effectuées en même temps pour les deux analyses. Une liste de protéines quantifiées par spectral count a pu être proposée pour chaque échantillon.

La figure 119 montre les résultats obtenus en termes de nombre d’identifications protéiques. Dans l’analyse 1, environ 30 % de protéines supplémentaires ont été identifiées.

Partie III Chapitre 2 : Recherche de biomarqueurs de cellules souches cancéreuses de glioblastomes

▐ 160 Figure 119

Comparaison du nombre de protéines identifiées dans chacun des deux échantillons déposés sur chaque gel

Une analyse du nombre de protéines identifiées par bande montre des différences qui semblent résulter d’une migration différente au sein du gel (cf. figure 120 ). Ainsi, pour chaque échantillon, le nombre de protéines identifiées diffère d’une bande à l’autre.

Figure 120

Nombre de protéines identifiées par bande dans chaque échantillon et sur chaque gel

Éch 1: Gel 1 Éch 1: Gel 2 Éch 2: Gel 1 Éch 2: Gel 2 2519 248 921 Gel 1 Gel 2 Échantillon 1 2432 397 990 Gel 2 Échantillon 2 Gel 1

Chapitre 2 : Recherche de biomarqueurs de cellules souches cancéreuses de glioblastomes Partie III

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Afin de s’affranchir de ce problème, une normalisation des données a été envisagée. En effet, les variations étant ici plus fortes que celles observées sur le digestat de levure, l’hypothèse a été formulée que la normalisation permettrait de corriger ces dernières. Plusieurs méthodes ont été testées :

 Pas de normalisation

 Normalisation par le nombre total de spectres totaux assignés

 Normalisation par le nombre total de spectres assignés dans chaque groupe de 10 bandes

 _{Normalisation par le nombre total de spectres assignés par groupe de masses (9 groupes de}

20 000 Da)

 Normalisation par le nombre total de spectres assignés à la trypsine par groupe de 10 bandes Les résultats obtenus, présentés dans la figure 121, montrent le coefficient de variation médian issu de la comparaison de l’échantillon 1 (gels 1 et 2) suivant différents types de normalisation et en appliquant des filtres sur le nombre de spectres minimum exigé par protéine (aucun, nombre de spectres supérieur à 1 et nombre de spectres supérieur à 5). La normalisation n’apporte pas de réelle amélioration des coefficients de variation médians. Elle empire même parfois les résultats (cf. normalisation par rapport à la masse de la protéine ou normalisation par la quantité de trypsine). Par contre, si l’on considère uniquement les protéines avec un nombre de spectres supérieur à 5, les coefficients de variation médians deviennent corrects (environ 21 % de variation entre les deux analyses). Ici, on notera que les valeurs obtenues sont comparables à celles obtenues pour la levure malgré l’ajout d’une importante source de variabilité technique.

Figure 121

Coefficient de variation médian calculé pour les analyses de l’échantillon 1, entre le gel 1 et le gel 2, en fonction du type de normalisation utilisé et du nombre minimum de spectres exigés

Ainsi, si l’on considère uniquement les protéines ayant un nombre de spectres minimal de 5, plus de 50 % des protéines ont un coefficient de variation médian inférieur à 30 % (cf. figure 122).

70 ₆₉ 62 85 74 36 ₃₂ 36 70 42 22 ₂₁ 22 51 36 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Sans normalisation Normalisation par nombre total de spectres Normalisation par 10 bandes Nomalisation par masse Normalisation par trypsine C o e ffi cien t d e var iat io n m é d ian Total s>1 s>5

Partie III Chapitre 2 : Recherche de biomarqueurs de cellules souches cancéreuses de glioblastomes

▐ 162 Figure 122

Nombre de protéines identifiées suivant le coefficient de variation médian et le type de normalisation appliqué

Pour conclure, une comparaison des échantillons analysés au cours du projet « glioblastome » semble pertinente car les coefficients de variation médians restent similaires à ceux qui ont été obtenus lors de l’évaluation de la reproductibilité des analyses du digestat de levure. Cependant, l’utilisation de statistiques apparaît ici risquée : au vu des biais, le nombre de faux positifs risque d’être élevé. C’est pourquoi, dans le cadre de ce projet, une interprétation manuelle sur des jeux de protéines potentiellement intéressantes a été réalisée.