Contrôle qualité 1 : le digestat de BSA

Le contrôle qualité 1 est basé sur le suivi de deux peptides de masses différentes (m/z = 722,33 et m/z = 464,25) extraits du digestat de BSA. L’objectif est ici de vérifier de manière simple et rapide le bon fonctionnement du couplage nanoLC-MS/MS avant l’injection de chaque nouvel échantillon correspondant à un patient différent. Au total, sur les 4 semaines d’analyse, 143 digestats de BSA ont été injectés. À noter que la lock mass (m/z = 922,0098), masse de référence ionisée en permanence dans la source et permettant de mesurer à chaque instant la dérive de l’étalonnage en masse de l’appareil, a aussi été utilisée. Ce composé sert notamment à étalonner les spectres MS et MS/MS après acquisition. Il permet de s’affranchir des effets de dérive de masse dus à la dilation du tube de vol lors de variations de température.

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D.1.1. Contrôles de la chromatographie

La reproductibilité chromatographique est un paramètre crucial pour assurer une extraction optimale des courants d’ions de chacun des peptides et donc une comparaison fiable des échantillons. Il s’agit ici de vérifier la stabilité de la colonne, l’absence de volumes morts, le bon fonctionnement du système et notamment des pompes. Deux paramètres ont été suivis sur chacun des deux peptides : reproductibilité des temps de rétention et largeur à mi-hauteur du pic chromatographique.

La stabilité des temps de rétention a été contrôlée tout au long des injections pour chacun des deux peptides extraits du digestat de BSA (cf. figure 137). Les coefficients de variation du peptide 1 et du peptide 2 sont de 1,2 % et 0,6 % attestant ainsi la stabilité de ce paramètre au cours des 143 injections réalisées. Les quelques valeurs déviantes ont été observées à la suite d’injections d’échantillons particulièrement concentrés en protéines.

Figure 137

Suivi des temps de rétention de deux peptides extraits du digestat de BSA (m/z = 722,33 et m/z = 465,25) au cours des 143 injections

La largeur à mi-hauteur (FWMH) de chacun des deux peptides a été suivie pour les 143 injections de BSA (cf. figure 138). Hormis pour les quinze premières injections, les valeurs sont largement inférieures au seuil critique d’intervention fixé à 0,10 min. La variation observée pour les quinze premiers échantillons est due à l’ordre d’injection. En effet, le digestat de BSA était analysé directement après l’échantillon. Ceci nous a permis de constater qu’un rééquilibrage de la colonne était nécessaire après l’analyse de chaque échantillon. Ce protocole a été mis en place pour les injections 15 à 143.

7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Tem p s d e r é te n tion (m in )

Numéro d'injection de la BSA

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▐ 188 Figure 138

Suivi de la largeur à mi-hauteur (FWMH) pour chacun des deux peptides extraits du digestat de BSA (m/z = 722,33 et m/z = 465,25) tout au long des 143 injections

D.1.2. Contrôle des paramètres de spectrométrie de masse

Le suivi des paramètres de spectrométrie de masse a pour but d’évaluer la nécessité d’un nettoyage ou d’un réétalonnage de l’appareil. Trois indicateurs ont été suivis : l’intensité et la résolution spectrale des deux peptides extraits du digestat de BSA ainsi que l’erreur constatée sur la lock mass (m/z = 922,0098). Des valeurs définissant un seuil d’intervention ont été établies pour chacun des paramètres.

La figure 139 montre la variation des intensités des deux peptides extraits du digestat de BSA. Il s’agissait ici de vérifier que l’intensité était supérieure au seuil critique d’intervention (I > 10⁶) déterminé lors d’expériences précédentes. Il est important de noter que ce paramètre ne permet pas de vérifier la reproductibilité des injections dans le sens où le digestat de BSA n’est pas stable au cours du temps.

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Figure 139

Suivi de l'intensité des deux peptides extraits du digestat de BSA (m/z = 722,33 et m/z = 465,25) tout au long des 143 analyses

La ligne rouge définit le seuil critique d’intervention (I = 10⁶). Les traits verticaux indiquent le numéro de préparation de la BSA.

La figure 140 montre l’évolution de la résolution spectrale tout au long des analyses. Le seuil critique d’intervention a été fixé pour une résolution inférieure à 30 000. Toutes les valeurs sont bien supérieures à la valeur seuil.

Figure 140

Variation de la résolution spectrale pour les deux peptides extraits du digestat de BSA (m/z = 722,33 et m/z = 465,25) tout au long des 143 analyses

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La figure 141 montre la variation de l’erreur sur la lock mass (m/z = 922,0098) tout au long des 143 analyses de la BSA. Il s’agissait ici d’évaluer directement le moment où un étalonnage de l’appareil était absolument nécessaire, c’est-à-dire lorsque l’erreur dépassait 20 ppm. Ce suivi a été crucial pour deux raisons :

 Un nouvel appareil de type Q-TOF était en cours d’installation dans la pièce où ont été réalisées les analyses. Les démarrages et arrêts successifs de cet instrument ont entraîné des variations de température importantes et donc une stabilité de l’étalonnage amoindrie.

 Tout nouvel étalonnage entraîne des manipulations de la source et comporte ainsi le risque non négligeable de détériorer le sprayer.

Au cours des quatre semaines, quatre étalonnages ont été effectués.

Figure 141

Variation de l'erreur sur la détermination de la masse de la lock mass (m/z = 922,09)

Le seuil critique d’étalonnage indiqué par les lignes rouges a été fixé pour une erreur de 20 ppm. Les flèches rouges indiquent les moments où un réétalonnage de l’appareil a été réalisé.