La spectrométrie de masse en tandem

L’analyse protéomique à haut débit était à ses débuts réalisée à l’aide d’acquisition MS des peptides issus de la protéine digérée. Par la suite, des techniques de MS/MS, impliquant une fragmentation de l’ion précurseur, ont été implémentées et ont permis une meilleure caractérisation des peptides. Il existe deux façons d’utiliser les analyseurs afin d’effectuer des expériences de spectrométrie de masse en tandem :

 _{Dans l’espace : utilisation de deux analyseurs (Q-TOF, QQQ)}  Dans le temps : utilisation d’un seul analyseur (IT)

B.2.1. Modes d’acquisition

Le mode d’acquisition principal utilisé au cours de ces travaux est le mode DDA (data dependent

acquisition). Il consiste en l’alternance de scans MS et MS/MS. Un exemple est montré en figure 18 : les

trois ions les plus intenses sont sélectionnés sur le spectre MS pour être fragmentés en MS/MS. Le temps de cycle est alors de 2,2 s.

Chapitre 2 : les outils de la protéomique pour la recherche de biomarqueurs Partie I

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Figure 18

Représentation schématique du mode d'acquisition DDA (data dependant acquisition)

Dans cet exemple, 3 ions marqués par des étoiles sont sélectionnés sur le spectre MS pour la MS/MS.

Cependant, bien qu’ayant prouvé son efficacité, ce mode d’acquisition présente une limitation majeure : la stochastique de la sélection des ions. Ainsi, tous les ions du spectre MS ne sont pas sélectionnés pour la MS/MS. Par ailleurs, les ions élués par la chromatographie pendant la fragmentation MS/MS ne seront pas sélectionnés.

Afin de s’affranchir de ce problème, des modes d’acquisition appelés DIA (data independant

acquisition) sont en cours de développement. Dans ce cas, les ions ne sont plus sélectionnés pour la

fragmentation. Il existe deux techniques majeures décrites plus précisément dans la Partie III  chapitre 2 :

 Isolation séquentielle et fragmentation des précurseurs sur une certaine fenêtre de masse (SWATH¹¹⁴, PacIFIC¹¹⁵)

 Alternance de scans basse et haute énergies (MS^E)¹¹⁶

B.2.2. Types de fragmentation

Il existe trois types de fragmentation principaux : CID (collision induced dissociation)¹¹⁷, ETD (electron

transfert dissociation)¹¹⁸ et ECD (electron collision dissociation)¹¹⁹. Seul le mode CID a été utilisé au cours de ces travaux et il sera par conséquent le seul à être présenté.

Au sein du mode CID, deux types d’énergies peuvent être appliqués : la basse (quelques eV) et la haute énergie (quelques keV). Les ions précurseurs sont dissociés par collision avec un gaz inerte (He, N2, Ar).

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La fragmentation a lieu sur la chaîne la plus labile à savoir sur la liaison amide (liaison peptidique) par l’apport d’un proton. Des ions b et y, selon la nomenclature de K. Biemann¹²⁰ établie en 1990 (cf. figure 19), sont majoritairement obtenus.

Figure 19

Nomenclature selon Biemann des ions obtenus à la suite d'une fragmentation CID de peptides

La séquence de chaque peptide est ensuite déterminée à partir de la masse des ions fragments successifs. Un exemple de spectre est présenté en figure 20.

Figure 20

Exemple de spectre MS/MS : peptide KMEINFIQLT 2+ à m/z = 618,84

Du point de vue mécanistique, la protonation a lieu sur des sites basiques avec l’ordre de préférence suivant : groupes basiques de la chaîne latérale > azote N-terminal > oxygène porté par le carbone de la liaison amide > azote de l’amide. Le modèle du proton mobile¹²¹ permet d’expliquer la fragmentation des peptides : l’énergie interne des ions augmente par collision avec les molécules de gaz et entraine une délocalisation du proton conduisant à la formation d’intermédiaires moins favorables énergétiquement.

Ceci explique la difficulté à fragmenter correctement les peptides trypsiques monochargés. Ainsi, dans ce cas, la charge est « séquestrée » au niveau de l’acide aminé basique en C-terminal (lysine ou arginine). L’énergie nécessaire pour délocaliser cette charge le long du squelette peptidique est élevée. Au contraire, dans le cas de peptides doublement chargés, les charges sont portées par l’acide aminé basique en C-terminal et l’azote N-terminal. Le proton situé en N-terminal est facilement transféré le long de la chaîne peptidique.

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B.2.3. Les analyseurs pour la spectrométrie de masse MS/MS

Cette partie présentera plus particulièrement les trois types d’instruments utilisés au cours de ces travaux de thèse :

 La trappe ionique

 Le Q-TOF

 _{Le QQQ}

B.2.3.a. La trappe ionique

La trappe ionique permet de réaliser des expériences de spectrométrie de masse MS², MS³, …, MSⁿ, grâce à ses capacités de piégeage et d’éjection sélective des ions. L’obtention de spectres MS/MS se déroule en deux étapes :

 Isolation de l’ion d’intérêt

Les ions de plus faible m/z que l’ion d’intérêt sont éjectés par un balayage croissant de l’amplitude. Puis les ions de m/z plus élevés sont mis en résonance et éjectés.

 Excitation et fragmentation des ions précurseurs

L’ion isolé est fragmenté par excitation à sa fréquence de résonance à l’aide de l’application d’une tension alternative sur l’électrode chapeau. L’amplitude de cette tension est plus faible que celle d’éjection et permet d’augmenter l’énergie cinétique des ions sans pour autant les éjecter de la trappe ionique. L’ion est ensuite fragmenté par conversion de cette énergie cinétique en énergie interne et collision avec les molécules d’hélium.

L’utilisation de la fréquence de résonance permet d’être très spécifique et de ne fragmenter que les ions précurseurs, sans affecter les ions fils.

B.2.3.b. Le Q-TOF

Un exemple de Q-TOF, le Maxis Impact (Bruker Daltonics) est présenté en figure 21. Lors de l’acquisition MS, le quadripôle est paramétré en mode RF only. Une large bande d’ions est transmise et séparée par le TOF avant détection. En mode, MS/MS, un précurseur (ion parent) est sélectionné par le quadripôle avant d’être fragmenté dans la cellule de collision. Les ions fils obtenus sont séparés dans le TOF avant la détection.

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▐ 46 Figure 21

Schéma du spectromètre de masse Q-TOF (Maxis Impact, Bruker Daltonics)

B.2.3.c. Le QQQ

La figure 22 présente le triple quadripôle TSQ Vantage^TM (Thermo Fisher Scientific). De par sa géométrie, le QQQ permet d’utiliser des fragmentations caractéristiques pour détecter et quantifier de manière spécifique des composés dans un mélange complexe. Ainsi, il est possible d’envisager plusieurs modes, par exemple¹²² :

 Product ion scanning : sélection du précurseur dans Q1, fragmentation dans Q2 et balayage de

l’ensemble des fragments dans Q3

 Precursor ion scanning : balayage des précurseurs dans Q1, fragmentation dans Q2 et sélection

d’un ion fils dans Q3

 Selected reaction monitoring (SRM) : sélection d’un ion parent dans Q1, fragmentation dans Q2

et sélection d’un ion fils dans Q3

Funnels Hexapôle Quadrupôle Cellule de collision Tube de vol Réflectron Détecteur (MCP) Accélérateur orthogonal Capillaire de transmission Entrée de N2 Source d’ionisation (ESI) Gradient de pression Ion Cooler _{250 cm}

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Figure 22

Schéma du triple quadripôle TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific)

Q00 et Q0 sont deux quadripôles utilisés pour la transmission des ions. L0, L11, L12, L21, L22, L23, L31, L32 et L33 sont des lentilles permettant de focaliser les ions. Q1, Q2 et Q3 sont les trois quadripôles. Le détecteur est un channeltron (dynode de conversion et multiplicateur d’électrons).