2. Matériel et méthodes
2.1. Stabilité d’émulsions huile /eau
2.1.1.1. PLs
Les PLs utilisés sont un mélange pour CLHP (chromatographie liquide haute performance) de la société Supelco. Ils sont composés de 7,8 mg de PLs de soja, dont 3,0 mg de PC, 2,4 mg de PE, 1,8 mg de Pi et 0,6 mg de lyso-PC. Après dissolution des PLs dans 2 mL de chloroforme, ils sont aliquotés en fractions de 1 mg et évaporés sous courant d’azote.
2.1.1.2. TGs
• Huile d’olive (Sigma diagnostics for lipase activity)
L’huile d’olive native contient des phospholipides. Afin de s’affranchir de ces tensioactifs, nous purifions l’huile d’olive par des lavages successifs avec de l’eau milli-Q dans une ampoule à décanter. Un mélange d’huile d’olive / eau (v / v, 1 / 1,5) est vivement agité. L’ampoule est laissée à décanter puis les phases aqueuses et émulsionnées sont éliminées, seule la phase grasse homogène est conservée. L’opération est renouvelée autant de fois que nécessaire, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’émulsion visible.
• Huile de tournesol de cuisine
L’huile utilisée est de marque Leader Price et a été achetée dans la grande distribution. Pour les expériences réalisées sur la balance de Langmuir, elle a été au préalable filtrée sur colonne Sep-Pak Silica Cartridges (Waters Corporation, Massachusetts, USA). Chaque colonne ne sert qu’à filtrer 3 mL d’huile.
• Trioléine et trilinoléine
Un mélange trioléine / trilinoléine (1 / 2) décrit par Tzen et Huang (1992) a été utilisé. La trilinoléine C18 :2, [cis,cis]-9,12 et la trioléine C18 :1, [cis]-9 proviennent de chez Sigma et sont pures à 99 % environ.
2.1.2. Fabrication de l’émulsion
Ce protocole a été établi à partir des articles de Tzen et al. (1992 et 1998), Chen et Tzen (2001) et Beisson et al. (2001b) pour reconstituer des oléosomes. 0,01 mg de PLs dissous dans du chloroforme sont mis au fond d’un microtube et le chloroforme est évaporé sous courant d’air comprimé. 3,3 µL de TGs sont ensuite ajoutés dans le tube. Le volume est
complété à 1 mL par ajout d’un tampon de phosphate de sodium pH 7,5 (NaH2PO4-2H2O et
Na2HPO4-12H2O). Après 30 s d’agitation au vortex, les solutions sont soniquées à l’aide d’un
appareil Digital Sonifier II, W-450 (Branson, Genève, Suisse) sur lequel est adapté une sonde en titane de 3 mm (adaptée à des volumes de 0,3 à 5 mL). La puissance maximale délivrée par l’appareil est de 400 W. Nous l’utilisons à 10 % de sa puissance (soit environ 10 W délivrés dans 1 mL) pendant 15 s, suivi de 5 min de repos de l’échantillon sur de la glace. L’opération est renouvelée 2 fois (entre deux échantillons, la sonde est soigneusement lavée et séchée).
2.1.3. Suivi de la stabilité de l’émulsion 2.1.3.1. Spectrophotométrie
On suit le crémage de l’émulsion par la diminution de l’absorbance dans sa partie inférieure, les lipides montant peu à peu à la surface. Pour cela, l’émulsion est transférée dans une cuve spectrophométrique à usage unique de capacité 1 à 3 mL (dimensions de la fenêtre de lecture (mm) : 23 x 5 x 10) recouverte d’un parafilm. La variation de la turbidité de l’émulsion est suivie par la mesure à 20 °C de l’absorbance à 600 nm de la phase inférieure à intervalles réguliers (toutes les 30 minutes) pendant des temps longs (de 15 h à 5 jours) sur un appareil DU 640B Spectrophotometer (Beckman-Coulter, USA). Les cuves restent dans l’appareil pendant toute la cinétique.
Le résultat est représenté graphiquement de l’une des façons suivantes : - A = f(t)
- A / A0 = f(t) d’après Kim et al. (2002)
- T / T0 = f(t) avec T la turbidité, T = 10A (Tzen et Huang, 1992)
2.1.3.2. Microscopie optique
Une goutte de l’émulsion est déposée sur une lame, puis recouverte d’une lamelle. L’émulsion est ainsi observée au microscope optique avec un objectif à immersion 100 x (appareil Olympus BX51) afin de mesurer la taille des globules gras. Les photographies sont prises avec une caméra Cool SNAP d’oculaire 10 x, couplée au microscope, et enregistrées à l’aide du logiciel Photometrics Cool SNAP.
Afin de mettre en évidence l’origine lipidique des globules observés (Greenspan et al., 1985), une coloration au rouge Nil (Molecular Bioprobe) de l’échantillon a été réalisée. La solution mère est constituée de 1 mg de rouge Nil dissous dans 1 mL d’éthanol et est conservée à -20 °C. Pour colorer les globules lipidiques, la solution mère est diluée 10 fois dans de l’éthanol puis est ajoutée sur la lame, au bord de la lamelle. Le rouge Nil pénètre par diffusion entre la lame et la lamelle. Après 30 min de repos, les corps lipidiques sont observés à travers des filtres WIG ou WB pour fluorescence.
2.1.3.3. Diffusion dynamique de la lumière
La diffusion dynamique de la lumière permet de déterminer la taille (rayon hydrodynamique) des particules diffusantes, leur masse moléculaire (si d’autres paramètres sont connus) et dans certains cas, la poly-dispersité. Pour cela, l’échantillon est éclairé par un faisceau lumineux polarisé linéairement délivré par un laser. Le principe de la diffusion de la lumière est basé sur l’analyse de l’interaction entre un faisceau laser et une émulsion pour en déduire le coefficient de diffusion des particules. L’interaction entre les particules et les ondes électromagnétiques produit un modèle de diffraction dont la nature dépend de la position relative des particules dans la cellule de mesure. Si ce modèle de diffraction est observé sur un temps très court, on observe des variations de l’intensité diffractée avec le temps. Ces fluctuations sont induites par le mouvement des particules dû à l’agitation thermique : autrement dit, la fréquence des variations dépend de la vitesse des particules et donc de la taille de ces dernières. Le diamètre hydrodynamique des particules est calculé selon la théorie de Mie. L’appareil utilisé est un modèle à rétrodiffusion HPPS 5001 de la société Malvern Instruments. Il permet de mesurer des diamètres hydrodynamiques compris entre 0,6 et 6000 nm, correspondant à des masses
moléculaires de 103 (ou moins : exemple du cholestérol) à 107 Da. Il est sensible jusqu’à
0,1 mg.mL-1 de lysozyme et les volumes requis sont de 12 µL à 3 mL. La température est
régulée par effet Peltier. Pour pouvoir déduire des tailles de particules à partir d’une mesure par diffusion de la lumière, il est nécessaire de connaître les paramètres de viscosité et l’indice de réfraction des particules et du solvant. D’après Attaie et Richter (2000) et Michalski et al. (2001), à 20 °C, l’indice de réfraction (n) de globules gras du lait est estimé à 1,45-1,46 et celui de l’eau est de 1,33. La viscosité de l’eau en fonction de la température est donnée par des tables (annexe 1). Les particules lipidiques sont diluées dans de l’eau milli-Q. Par ailleurs, des particules de latex (standard de diamètre 199 nm ± 6 nm, Duke Scientific), dissoutes dans de l’eau milli-Q sont utilisées pour vérifier la validité de la mesure. Les expériences sont réalisées dans une microcuve plastique de contenance 1 mL, à 20 °C. Les mesures sont
réalisées en mode automatique. Chaque mesure consiste en 10 à 15 cycles de 10 s et est répétée 5 fois.