Dosage des acides gras

Après méthylation des échantillons (d’après Morrison et Smith, 1964), ils sont analysés par CPG (chromatographie en phase gazeuse) selon le protocole décrit par Athenstaedt et al. (1999).

2.3.7.1. Méthylation des acides gras

50 µL d’extraits lipidiques, solubilisés dans du chloroforme / méthanol (2 / 1, v / v), sont introduits dans des tubes en verre à bouchon à vis. Le chloroforme / méthanol est évaporé sous courant d’azote puis 1 mL de BF3 / méthanol 14 % est ajouté. Les tubes sont soigneusement re-bouchés et incubés pendant 10 min dans du sable chauffé à 100 °C. Après refroidissement, on ajoute 0,86 mL de benzol et on chauffe pendant 30 min à 100 °C. Lorsque les tubes sont froids, 1 mL d’eau est ajouté. On procède alors à 3 extractions à l’éther de pétrole : incubation 15 min avec 2 mL d’éther de pétrole puis centrifugation 2 min à 2000 x g. A chaque extraction, la phase supérieure est récupérée et transvasée dans un tube propre. L’éther de pétrole est finalement évaporé sous courant d’azote. Les esters méthyliques sont stockés à –20 °C.

2.3.7.2. CPG

Les esters méthyliques sont séparés et quantifiés à l’aide d’un chromatographe Hewlett Packard 5890 couplé à un détecteur à ionisation de flamme (320 °C) et d’une colonne capillaire Hewlett Packard 5 (30 m x 0,32 mm x 0,25 µm d’épaisseur de film). Après 2 min à

150 °C, la température est élevée à 300 °C progressivement (10 °C.min-1). La température de

300 °C est maintenue 5 min. Le gaz porteur est de l’azote et 1 µL d’échantillon est injecté dans la colonne (température de l’injecteur : 320 °C). Les acides gras sont identifiés par comparaison à des standards commerciaux d’esters méthyliques d’acides gras (NuCheck, Inc., Elysian, MN).

2.3.8. Isolement des corps lipidiques

Les particules lipidiques sont isolées selon un protocole dérivé de ceux de Daum et al. (1982) pour l’extraction des sphéroplastes et de Leber et al. (1994) pour l’isolement des particules lipidiques à partir des sphéroplastes. Les cellules cultivées pendant 20 h, à 28 °C, en milieu minimum enrichi à 5 % d’acide oléique ont été récoltées puis lavées trois fois avec 0,5 % de SAB et une fois à l’eau milli-Q. Pour 1 g de masse humide, récupéré après centrifugation et

élimination du surnageant, 2 mL d’un tampon A (0,1 M Tris/H2SO4, pH 9,4) et 3,086 mg de

1,4-dithiothreitol sont ajoutés sur le culot de cellules. L’échantillon est incubé 10 min à 30 °C sous agitation puis centrifugé. Le culot de cellules obtenu est resuspendu avec 6,67 mL d’un

tampon B (1,2 M sorbitol, 20 mM KH2PO4, pH 7,42) et 2 mg de zymolase (lyticase, Sigma).

Cette enzyme clive les structures glucidiques de la paroi cellulaire de la levure et on aboutit à la formation de sphéroplastes (Zinser et Daum, 1995). Après 45 min à 30 °C, sous agitation, la concentration en sorbitol de l’échantillon est abaissée à 0,8 M par ajout d’eau milli-Q. Toutes les étapes suivantes se font à froid, avec des solutions conservées sur de la glace pour maintenir les organelles intactes. Les cellules sont alors centrifugées puis lavées 2 fois avec le tampon B dilué à 0,8 M sorbitol. Afin d’isoler les particules lipidiques à partir de ces sphéroplastes, on broie les cellules par 30 mouvements minimum d’aller-retour dans un potter, sur de la glace, en présence de 5 mL d’un tampon A (6 % ficoll 400 en tampon 10 mM

MES/Tris pH 6,9 et 0,2 mM Na2EDTA) et de PMSF (1 mM final, en stock dans du DMSO).

L’échantillon est transféré dans des tubes à ultra-centrifugeuse, en les remplissant à ras bord avec du tampon A. Après 60 min de centrifugation à 100000 x g, la phase supérieure grasse est récoltée à l’aide d’une spatule et transférée dans un potter propre. On dilue alors par un petit volume d’un tampon C (0,6 M sorbitol et 8 % ficoll dans un tampon 10 mM MES/Tris

pH 6,9 et 0,2 mM Na2EDTA), en présence de 1 mM de PMSF, et on procède à une

homogénéisation par quelques mouvements doux du piston dans le potter. L’échantillon, contenu dans le potter, est alors récupéré dans une seringue puis vidé doucement au fond d’un tube à ultra-centrifugeuse rempli au préalable d’un tampon D à 0,25 M sorbitol dans 10 mM

MES/Tris pH 6,9 et 0,2 mM Na2EDTA. On crée ainsi un gradient en concentration de sorbitol

dans le tube. Après une centrifugation de 30 min à 100000 x g, la phase supérieure grasse est à nouveau récupérée et transférée dans un potter propre en présence d’un peu de tampon D et de PMSF, broyée, puis est mise au fond d’un tube rempli d’un tampon E (0,15 M sorbitol

centrifugation à 100000 x g pendant 30 min, les corps lipidiques flottant à la surface des tubes sont récupérés.

Une étape supplémentaire de lavage des corps lipidiques peut être effectuée en présence de KCl afin d’améliorer la purification et l’élimination de protéines contaminantes. Pour cela, 500 µL de corps lipidiques sont incubés avec 500 µL de KCl 1 M pendant 15 min sur de la glace, en mélangeant doucement toutes les 5 min par retournement du microtube. L’échantillon est ensuite transvasé dans un tube à ultra-centrifugeuse rempli de solution de KCl. Après une centrifugation de 15 min à 100000 x g à 4 °C, les corps lipidiques isolés et purifiés sont récupérés à la surface du tube.

2.3.8.1. Analyse quantitative des protéines totales

Les protéines sont dosées selon la méthode de Lowry et al. (1951) après délipidation des échantillons au diéthyl-éther et précipitation des protéines au TCA. La délipidation est conduite de la manière suivante : on ajoute 2 volumes de diéthyl-éther à 1 volume de corps lipidiques purs d’environ 200 µL. Le mélange est vortexé toutes les 5 min pendant 20 min puis centrifugé 10 min à 4 °C, 15000 x g. La phase supérieure est enlevée par aspiration et le reste d’éther évaporé sous courant d’azote. La phase inférieure aqueuse est récupérée et les protéines sont précipitées au TCA selon le protocole suivant : l’échantillon est complété à 400 µL par ajout d’eau milli-Q et 100 µL de TCA 50 % froid sont ajoutés (concentration finale de 10 %). Après 1 h d’incubation sur la glace, on centrifuge 10 min à 15000 x g. La phase supérieure est éliminée par aspiration. Le culot de protéines est repris avec 125 µL d’une solution contenant 0,1 M de NaOH et 0,1 % de SDS. L’échantillon est incubé à 37 °C et il est régulièrement vortexé pendant 30 min. Dans un tube en verre, 300 µL d’eau milli-Q, 100 µL d’échantillon protéique et 2 mL d’une solution composée de 220 µL de tartrate disodique à 2,2 % (p / v), 220 µL de sulfate de cuivre à 1 % (p / v), 550 µL de SDS à 20 % (p

/ v) et 22 mL de NaOH 0,1 M contenant 2 % Na2CO3 sont mélangés au vortex. Après 10 min

d’attente, 200 µL de réactif de Folin et Ciocalteu (2 / 1 dans de l’eau) sont additionnés dans

les tubes. Entre 30 min et 2 h plus tard, l’A546nm de l’échantillon est lue par

spectrophotométrie. On déduit la concentration en protéines (en µg.µL-1) de l’échantillon en

fonction d’une gamme étalon effectuée au laboratoire sur de la SAB.

2.3.8.2. Pureté des corps lipidiques

La contamination croisée éventuelle des corps lipidiques par des peroxysomes est vérifiée par western-blot à l’aide d’anticorps anti-acyl-coA-oxydase 3 (Aox3p) (fournis par J.-M. Nicaud,

laboratoire de microbiologie et génétique moléculaire des microorganismes, CNRS / INRA / INA P-G, Grignon).

Le bilan des études réalisées sur les corps lipidiques de la levure Y. lipolytica est représenté sur le diagramme suivant (Figure 22).

Figure 22 : Diagramme d’étude des lipides et des protéines de Y. lipolytica.