Dosage des lipides

• Extraits totaux de cellule

Les phospholipides sont répartis de la manière décrite dans le Tableau 5. Tout comme chez les végétaux, la PC est le PL cellulaire majoritaire.

Tableau 5 : Répartition des phospholipides (en %) dans les extraits totaux de Y. lipolytica.

% LP DMPE CL PA PS Pi PE PC

W29 nd 2,1 7,7 5,9 2,9 11 24,3 46,1

Nous avons obtenu par chromatographie sur couche mince, les résultats présentés dans le Tableau 6 concernant la teneur en lipides neutres des extraits cellulaires totaux.

Tableau 6 : Dosage des lipides neutres dans des extraits totaux de Y. lipolytica après 20 h de culture. Quantités exprimées en µg.µg-1 _{de protéines.}

ergostérols esters d’ergostérols triglycérides

en µg.µg-1 protéines 0,025 0,02 2,625

1 2 3

Aox

1 2 3

L’acide oléique est l’acide gras majoritaire dans la cellule (Tableau 7), mais d’autres acides gras sont aussi présents dans les corps lipidiques, en quantités décroissantes lorsque l’on descend en nombre de carbone. La forme d’apport extracellulaire (C18:1) ne représente ainsi que 50 % des acides gras totaux intracellulaires. Les autres acides gras sont issus du métabolisme, avec notamment l’activité C-2 de la β-oxydation peroxysomiale. Le rapport acides gras insaturés / acides gras saturés est de 14,8 et la répartition C14:1 / C16:1 / C18:1 de 22 / 35 / 100 (Tableau 7).

Tableau 7 : Répartition des acides gras (%) dans les extraits totaux de Y. lipolytica.

C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:1 W29 0 11,5 5,0 18,7 1,3 53,2 7,6 0 2,6

• Particules lipidiques isolées

L’analyse des PLs du globule gras isolé de Y. lipolytica a donné les résultats reportés dans le Tableau 8. A nouveau, la PC est le PL majoritaire, mais la composition globale est très différente de celle trouvée chez S. cerevisiae (1.3.3). Nous avons notamment des quantités bien inférieures en PLs chargés négativement : 5 % de Pi + PS chez Y. lipolytica contre 37 % chez S. cerevisiae.

Tableau 8 : Répartition des phospholipides dans les particules lipidiques de Y. lipolytica.

% LP DMPE CL PA PS PI PE PC

W29 0,45 0,57 6,53 1,93 2,15 2,87 5,89 79,61

La présence de LP vus dans le Tableau 8, qui n’était pas mise en évidence dans les extraits totaux, vient certainement de l’enrichissement en ce PL dans les particules lipidiques, alors qu’il était très minoritaire dans l’extrait total.

D’après le Tableau 9, les TGs sont les lipides neutres majoritaires du globule gras. Ceci est proche des oléosomes végétaux mais très éloigné de la composition des globules lipidiques de

S. cerevisiae, où les TGs et les stérols sont présents en quantité équivalente. Les levures ont

été préalablement cultivées sur un milieu enrichi à 5 % en acide oléique, alors que S.

cerevisiae dans l’article de Leber et al. (1994) était cultivée sur un milieu contenant du

glucose. La richesse en TGs des globules lipidiques de Y. lipolytica est certainement une conséquence de l’apport très important de TGs par le milieu nutritif et la composition lipidique des globules est représentative des lipides sur lesquels pousse la levure.

Tableau 9 : Dosage des lipides neutres dans des particules lipidiques isolées après 20 h de culture de Y.

lipolytica. Quantités exprimées en µg.µg-1 de protéines.

ergostérols esters d’ergostérols triglycérides

en µg.µg-1 protéines 0,057 0,05 13,4

Le Tableau 10 met en évidence l’importance du C18 :1 dans les corps lipidiques de stockage. Cet acide gras est celui contenu dans le substrat. Il y a donc peu de modification lors du stockage des lipides apportés par le milieu de culture. Le rapport acides gras insaturés / acides gras saturés est de 12,8 et la répartition C14:1 / C16:1 / C18:1 est la suivante : 2 / 24 / 100.

Tableau 10 : Répartition des acides gras dans les corps lipidiques isolés de Y. lipolytica.

C14:0 C14:1 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:1 W29 0,6 1,3 5,5 15,8 1,1 65,8 8,7 0,5 0,7

• Bilan

Les deux extraits (total et lipidique) sont finalement comparés dans la Figure 36. Nous avons

2,67 µg de lipides neutres.µg-1 de protéines dans les extraits totaux contre 13,5 µg.µg-1 dans

les corps lipidiques isolés. Les rapports TG / (ergostérols + esters d’ergostérols) sont de 58 pour les extraits cellulaires et 125 pour les corps lipidiques.

Figure 36 : Dosage des acides gras dans les extraits totaux (EB) et dans les particules lipidiques isolées de

Y. lipolytica.

Aucune étude n’avait été réalisée jusqu’à présent sur le stockage des lipides par des levures cultivées sur un milieu nutritif enrichi en lipides, l’essentiel des recherches sur les globules

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 C14:0 C14:1 C16:0 C16 :1 C18 :0 C18 :1 C18 :2 C18 :3 C20:0 C20:1 (% ) EB corps lipidiques

lipidiques ayant été réalisées sur Saccharomyces cerevisiae, cultivée en milieu glucidique. Nous avons montré que, dans nos conditions de culture, la composition cellulaire globale de

Y. lipolytica et celle de ses corps lipidiques différent surtout dans l’importance relative du

C18:1 par rapport aux autres acides gras. Le corps lipidique est ainsi un lieu de stockage des lipides captés dans le milieu, quasiment sans modification préalable. Au contraire, dans le reste de la cellule, nous avons mis en évidence un métabolisme important des lipides, avec certainement le signe de la β-oxydation dans les peroxysomes.

• Protéines

Les échantillons ont été déposés sur gel d’électrophorèse (dépôt de l’équivalent de 10 µg de protéines). Le résultat est présenté sur la Figure 37. D’après ces gels d’électrophorèse, la composition en protéines des corps lipidiques est beaucoup plus complexe chez la levure que chez les plantes (Figure 29).

Figure 37 : Electrophorèse SDS-PAGE sur des extraits cellulaires totaux (puits 1, 2 et 5) et des particules lipidiques isolées (3,4 et 6) de Y. lipolytica (1, 3, 5 et 6) et de S. cerevisiae (2 et 4) (offerts par K. Athenstaedt). EB = extrait brut, sph = particules lipidiques et M = marqueur de masse moléculaire.

Des western blots ont été réalisés successivement par incubation avec des anticorps dirigés contre des protéines du corps lipidique de S. cerevisiae : Erg1 (squalène époxydase), Erg6

(stérol-∆24-méthyltransférase) et Erg7 (lanostérol synthétase) (protéines identifiées par

Athenstaedt et al., 1999). Les blots obtenus sont montrés sur la Figure 38. Les anticorps réagissent fortement avec des protéines du corps lipidique de S. cerevisiae, mais pas avec l’extrait total des cellules. En effet, ces enzymes sont concentrées à la surface des corps lipidiques, alors qu’elles sont minoritaires dans le pool protéique total. En revanche, aucune protéine similaire n’est détectée dans les corps lipidiques de Y. lipolytica. Soit la composition en protéines des corps lipidiques des deux levures est très différente, soit les anticorps sont

M 1 2 3 4 M 5 6

Y.l. S.c. Y.l. S.c. Y.l. EB EB sph sph EB sph 94 67 43 30 M 1 2 3 4 M 5 6

Y.l. S.c. Y.l. S.c. Y.l. EB EB sph sph EB sph

M 1 2 3 4 M 5 6

Y.l. S.c. Y.l. S.c. Y.l. EB EB sph sph EB sph 94

67

43

très spécifiques et ils ne reconnaissent pas les isoformes des protéines exprimées chez Y.

lipolytica. Les trois enzymes existent chez les deux levures, c’est donc la deuxième hypothèse

qui est retenue.

Figure 38 : Western blot sur des extraits totaux (EB) et des corps lipidiques (sph) isolés de Y. lipolytica et

S. cerevisiae.

La disponibilité du génome de Y. lipolytica a confirmé l’absence d’homologues d’oléosines chez la levure mais a permis de mettre en évidence l’existence de protéines à motifs glycine répétés, motifs présents dans certaines isoformes d’oléosines. Le rôle et la localisation de ces protéines restent à préciser