1.5. Deux organismes modèles
1.5.2. Levure : Y lipolytica
Jusqu’à récemment, toutes les études sur les levures concernaient Saccharomyces cerevisiae, qui est responsable, entre autres, de la fermentation du pain et de la bière. Mais dès 1942, des chercheurs s’intéressent à une levure, appelée Candida lipolytica (puis Yarrowia dès 1980), qui possède des caractéristiques physiologiques peu communes (Barth et Gaillardin, 1996). En effet, cette levure, localisée notamment dans les produits laitiers et les charcuteries, peut croître sur des lipides et alcanes. Son génome est aujourd’hui entièrement séquencé (disponible sous forme de communication personnelle).
1.5.2.1. Physiologie de la cellule
La fréquence de sporulation est lente et la viabilité des spores est faible (Romanos et al., 1992). Ainsi, aucun cycle sexuel n’avait été démontré jusqu’à 1970 et elle avait été classée comme Candida. Sa température maximale de croissance est de 32-34 °C, en conditions aérobies. Elle assimile les n-alcanes, mais aussi les poly-alcools, les acides organiques et les
paraffines. Lorsqu’elle est cultivée sur du triacétate de glycérol comme seule source de carbone, il y a induction d’une activité extracellulaire lipolytique d’une estérase de basse masse moléculaire (Adoga et Mattey, 1979).
1.5.2.2. Métabolisme des lipides
Lors de la culture sur acide oléique, les substrats hydrophobes émulsionnés adhèrent à la surface de la levure (Aguedo et al., 2003). On observe ensuite à l’intérieur de la levure une prolifération des peroxysomes. En effet, la principale voie de dégradation des alcanes en acides gras est la β-oxydation peroxysomiale (Luo et al., 2000). Lors de cette dégradation des acides gras, il apparaît des acides gras plus courts de deux carbones à chaque cycle (Figure 18).
Le métabolisme des substances hydrophobes est intéressant puisqu’il peut aboutir à la synthèse de composés d’arômes (par exemple la γ-décalactone pour l’arôme de pêche), de polymères, d’émulsifiants, ou intervenir en dépollution des sols ou d’effluents des industries agroalimentaires, telles que les huiles.
Figure 18 : Différentes étapes de la β-oxydation peroxysomiale.
Le stockage des acides gras est effectué sous la forme de TGs dans des vacuoles lipidiques. Au laboratoire, des études sont actuellement menées sur les acyl-coA oxydases (AoxP). Il en existe cinq isoformes chez Y. lipolytica. Chaque isoforme a une activité spécifique, plus ou moins marquée, selon les longueurs de chaîne des acides gras. Ainsi, en modifiant le pool d’AoxP de la levure, on peut espérer synthétiser des acides gras de longueurs variées. Ceci est
R-CH2-CH2-CO-SCoA R-CH=CH-CO-SCoA R-CHOH-CH2-CO-SCoA R-CO-CH2-CO-SCoA R-CO-SCoA + CH3-CO-SCoA FAD FADH2 H2O2 H2O + 1/2O 2 O2 H2O HSCoA NAD+ NADH + H+ Acyl-CoA oxydase 2-énoyl-CoA hydratase 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase 3-cétoacyl-CoA thiolase R-CH2-CH2-CO-SCoA R-CH=CH-CO-SCoA R-CHOH-CH2-CO-SCoA R-CO-CH2-CO-SCoA R-CO-SCoA + CH3-CO-SCoA FAD FADH2 H2O2 H2O + 1/2O 2 O2 H2O HSCoA NAD+ NADH + H+ Acyl-CoA oxydase 2-énoyl-CoA hydratase 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase 3-cétoacyl-CoA thiolase
très important pour des applications industrielles : aspects nutritionnels et non alimentaires (savons, détergents et autres tensioactifs (Ohlrogge, 1994)).
Cette levure est capable de synthétiser un bioémulsifiant de nature lipide-protéine- polysaccharide lorsqu’elle est cultivée sur de l’huile du palmier Babassu comme seule source de carbone (Sarubbo et al., 1999).
De nombreux facteurs influencent la production de lipase par les microorganismes : la source de carbone, la source d’azote, la présence d’activateurs, de stimulateurs ou d’inhibiteurs, les agents affectant l’interface, la température, le pH, l’inoculum (Hadeball, 1991).
1.5.2.3. Expression de protéines hétérologues
Les levures peuvent être utilisées afin de produire des substances par génie génétique (Gaillardin et Heslot, 1987 ; Dominguez et al., 1998). Elles présentent l’avantage par rapport aux bactéries de pouvoir faire des modifications post-traductionnelles des protéines (Romanos
et al., 1992). Ensuite, la séparation de la cellule et de la protéine d’intérêt est plus aisée dans
la levure que chez la bactérie (classiquement E. coli). Y. lipolytica présente en plus l’avantage d’être GRAS (généralement admise comme saine). Alors que Saccharomyces cerevisiae (S.c.) secrète peu de grosses protéines dans le milieu de culture, Y. lipolytica peut secréter en quantité abondante des enzymes hydrolytiques telles que la protéase alcaline extracellulaire, des protéases acides et une ARNase.
La compagnie Pfizer a montré la possibilité de produire et secréter de la chymosine bovine par Y. lipolytica (Gaillardin et Heslot, 1988). Nicaud et ses collaborateurs (2002) ont utilisé Y.
lipolytica pour produire une lipase extracellulaire de Y. lipolytica ainsi qu’une leucine-amino
1.6.
But du travail
Dans une première partie, nous avons souhaité étudier la structure et la dynamique de globules lipidiques de levures, en comparaison à des oléosomes végétaux. Pour cela, nous avons choisi une plante modèle A. thaliana et une levure stockant en grande quantité des lipides : Y. lipolytica.
Dans une seconde partie, nous traitons des oléosines. Afin d’obtenir des oléosines recombinantes, nous avons utilisé deux systèmes connus pour leur efficacité dans l’expression de protéines recombinantes, l’un procaryote (la bactérie E. coli) et l’autre eucaryote (la levure
Y. lipolytica). Après avoir déterminé le meilleur système d’expression des oléosines, nous les
avons exprimées et purifiées. Nous nous sommes ensuite intéressés à leur structure ainsi qu’à leurs propriétés de surface à différentes interfaces. En effet, les oléosines ont été très étudiées ces dernières années mais la plupart des recherches ont porté sur la biogénèse des oléosomes et l’insertion des oléosines dans l’oléosome. Il y a peu de données disponibles actuellement sur les propriétés de surface aux interfaces, in vitro, de ces protéines fonctionnelles et les études passées n’ont toujours pas abouti à un consensus sur la structure des oléosines au sein de l’oléosome. Il existe en effet plusieurs hypothèses contradictoires : localisation en superficie de l’oléosome ou ancrage profond dans la matrice lipidique et structure du segment central majoritairement en hélices α ou en feuillets β.