Insertion du gène dans des vecteurs de sous-clonage

Les sous-clonages ont été réalisés dans des plasmides pET20 b (+) (Figure 40) de la société Novagen en vue de l’expression des protéines par E. coli. L’utilisation de ce plasmide permet l’ajout de 8 acides aminés, dont une queue de six histidine, à l’extrémité C–terminale des séquences codantes.

Pour les clonages dans Y. lipolytica, le sous-clonage a été réalisé directement dans le vecteur

d’expression pYEG1 (1,22 µg.µL-1) (Figure 41), fourni par J.-M. Nicaud. Ce vecteur permet

Le vecteur pET-20b(+) contient le promoteur de T7, le départ de la transcription de T7, des sites multiples de clonage (NcoI-XhoI), le terminateur de T7, l’origine de pBR322, la séquence codant la β-lactamase, l’origine f1, la séquence signal N-terminale pelB pour des localisations périplasmiques potentielles ainsi que la séquence His-

tag.

Ce vecteur navette permet l’intégration stable dans le génome de Y. lipolytica grâce aux éléments zéta (transposons). L’intégration se fait sans ajout de séquences bactériennes par l’insertion uniquement de la partie

coupée par NotI. Les souches de levures Ura- sont complémentées. La séquence XRP2 est un terminateur de transcription. Ce plasmide possède enfin le promoteur fort de l’Aox2, inductible à l’acide oléique.

Figure 41 : Plasmide d’expression pYEG1.

4.2.2.1. Digestions de l’ADN

Les inserts et les vecteurs sont d’abord digérés par les enzymes de restriction avant d’être ligaturés. Pour éviter les mauvaises insertions des gènes dans les vecteurs, les digestions ont été effectuées avec deux enzymes différentes aux extrémités 3’ et 5’ terminales, générant des fragments non cohésifs. Les enzymes de restriction et leurs tampons proviennent de la société Promega, exceptée BlnI (appelée aussi AvrII) qui provient de chez Biolabs.

Les digestions sont réalisées dans le mélange réactionnel suivant :

- 500 ng à 1 µg du fragment de PCR ou du vecteur d’expression

- 3 µL de tampon commercial 10x, choisi pour une activité optimale du mélange des deux enzymes de restriction

- 0,1 µL de chaque enzyme

- H2O qsp 30 µL.

Les échantillons sont ensuite mis à incuber au moins deux heures à 37 °C dans un four à hybridation (Amersham). Pour les digestions réalisées par SfiI, qui doivent être conduites à 60 °C, SfiI est tout d’abord introduite dans le milieu et incubée à 60 °C pendant une heure, puis la deuxième enzyme est rajoutée et l’incubation se poursuit au moins deux heures à 37 °C. pYEG1 5806 bps AvrII, 1080 SfiI, 1097 EcoRI, 1520, , NotI, 1917 NotI, 4127 Ura3d1 POX2p XPR2t zeta KanR zeta pYEG1_{5806 bps} AvrII, 1080 SfiI, 1097 EcoRI, 1520, , NotI, 1917 NotI, 4127 Ura3d1 POX2p XPR2t zeta KanR zeta

La digestion des plasmides peut être vérifiée sur gel d’agarose 0,8 % en comparant des vecteurs digérés ou non et éventuellement, si le taux de digestion est inférieur à 50 %, la digestion à 37 °C est prolongée.

4.2.2.2. Purification de l’ADN

Une fois les fragments d’ADN digérés, ils sont purifiés, afin d’éliminer la matrice de PCR, les dNTP, les oligonucléotides et les enzymes de restriction, soit après électrophorèse sur gel à l’aide du nébuliseur de gel «Amicon bioseparations, Ultrafree-DA for DNA extraction from agarose » de la société Millipore, soit par purification directe avec le kit « Wizard PCR preps » de la société Promega.

Les fragments sont ainsi utilisables pour un sous-clonage dans un vecteur plasmidique.

4.2.2.3. Ligature

Le produit de PCR digéré, purifié est inséré par ligature dans le vecteur d’expression, lui-aussi digéré et purifié. Une ligature optimale est observée pour un rapport molaire insert / vecteur = 3, avec une quantité d’environ 50 ng de vecteur. Les vecteurs et inserts sont quantifiés sur gel par rapport à des quantités croissantes connues d’un plasmide commercial pBR322

(Promega, 1 µg.µL-1) déposées sur le même gel (100 à 400 ng).

On utilise l’équation suivante pour déterminer la quantité de chacun des composants : (ng de vecteur)*(taille de l'insert en kb)

(taille du vecteur en kb) *(rapport insert/vecteur) = ng d'insert

Le mélange de ligature est alors le suivant : - X ng du vecteur d’expression - Y ng d’insert

- 10 µL de tampon de ligase 2x (fourni par la société Promega) - 1 µL de T4 DNA ligase (fournie par la société Promega)

- H2O qsp 20 µL

Il est incubé pendant 1 h à 16 °C puis une nuit à 4 °C.

4.2.2.4. Amplification de l’ADN plasmidique

• transformation de bactérie

Des cellules compétentes chimiques E. coli JM109 (Promega) (100 µL) en microtube stérile sont décongelées sur de la glace. Après l’ajout de 10 à 100 ng d’ADN plasmidique, les tubes sont encore laissés sur de la glace pendant 30 min. Ils sont alors transférés dans un bain-marie à 42 °C exactement, pendant 1 à 2 min. Ce choc thermique permet l’introduction du plasmide

dans la bactérie via des membranes fragilisées. 900 µL de milieu de Luria Bertani (LB) (1 % bactopeptone (p / v), 0,5 % extrait de levure (p / v), 1 % NaCl (p / v), pH 7) sont ajoutés stérilement et les tubes sont mis à incuber à 150 rpm, à 37 °C pendant 1 à 3 h. 100 µL du mélange de transformation sont alors étalés sur une boîte LB agar (15 % (p / v)), contenant

soit de l’ampicilline (Amp) (Amp sodium salt d’Euromedex) (100 µg.mL-1) pour le plasmide

pET20b, soit de la kanamycine (Kana) (sous forme de sulfate de Kana de la société USB)

(50 µg.mL-1) pour le plasmide pYEG1. Le reste des cellules est centrifugé, le surnageant jeté

et le culot re-étalé sur une nouvelle boîte. Les boîtes sont incubées à 37 °C sur la nuit. Les colonies bactériennes sont alors dénombrées, afin de mesurer l’efficacité de la transformation.

• Criblage des bactéries transformantes

Une sélection a été réalisée par l’étalement sur un milieu contenant soit de l’ampicilline, car

les plasmides pET20b expriment le gène de la β-lactamase qui confère la résistance à l’Amp,

soit sur un milieu contenant de la kanamycine pour lequel le plasmide pYEG1 exprime un gène de résistance.

Les colonies qui se sont développées sont ensuite criblées par PCR afin de mettre en évidence la présence ou non de l’insert. Pour cela, nous reproduisons la PCR décrite dans le tableau 4 avec le milieu réactionnel suivant : 1 PCR bead, 24 µL d’eau, 1 pointe de colonie prélevée avec un cône stérile et 0,2 µL des 2 amorces correspondantes (tableau 3). Les produits de PCR sont ensuite déposés sur gel d’agarose 0,8 %. Les colonies ne permettant pas l’amplification d’un fragment de la taille de l’insert sont rejetées.

Un deuxième criblage est effectué en redigérant les plasmides obtenus par les enzymes de restriction. Les clones négatifs seront ceux qui ne présentent pas après migration sur gel d’agarose une bande de la taille de l’insert.

• Extraction de plasmide

A partir des colonies qui se sont développées sur les boîtes, des cultures de 5 mL en milieu LBAmp ou LBKana liquides sont mises en route à 250 rpm, 37 °C, sur la nuit, en tubes en verre. Le lendemain, les plasmides sont extraits sur résine selon le protocole du kit « Wizard plus miniprep » de Promega.

Les plasmides sont quantifiés sur gel d’agarose en les comparant à des dépôts de quantités croissantes, connues, du plasmide PBR322.

Afin de s’assurer complètement de la réussite du clonage, 2 à 5 µg de plasmide et les amorces correspondantes sont envoyées pour séquençage à la société MWG Biotech AG.