Du sperme frais

1.1.1 Swim-up

Cette technique permet de r´ecup´erer uniquement des spermatozo¨ıdes purs qui sont les plus mobiles. La v´erification par l’observation au microscope affirme l’absence totale des cellules somatiques (dans les limites de la technique utilis´ee). Toutefois, une perte tr`es importante (90,4%) est remarqu´ee apr`es cette m´ethode de purification (Tableau 8). Les 10% des spermatozo¨ıdes r´ecup´er´es ne sont pas repr´esentatifs de l’´echantillon. Ainsi, cette technique n’est pas choisie pour la suite de la mise au point de l’´etude du transcriptome dans les gam`etes mˆales.

Echantillon 1 2 3 4 5

Nombre initial de spermatozo¨ıdes (millions) 50 22 25 45 23

Nombre de spermatozo¨ıdes apr`es le swim-up (millions) 7,2 0,5 3 3,8 1,8

Perte en spermatozo¨ıdes (%) 85,6 97,7 88 91,6 92,2

Tableau 8 – R´esultats obtenus apr`es capacitation pour 5 ´echantillons.

1.1.2 Lyse des cellules somatiques

La lyse des cellules somatiques est r´ealis´ee par la solution de lyse compos´ee de SDS et de Triton X-100 selon le protocole de Goodrich et al. (2007) jusqu’`a l’absence des cellules somatiques. Malgr´e trois lyses cons´ecutives de 30 minutes, les cellules somatiques persistent lors du contrˆole au microscope. De plus, une perte en spermatozo¨ıdes importante, avec une moyenne de 45,7%, est remarqu´ee apr`es trois cycles de lyse (Tableau 9). Nos r´esultats montrent que la lyse seule ne permet pas d’´eliminer toutes les cellules somatiques.

Echantillon 1 2 3 4 5

Nombre initial de spermatozo¨ıdes (millions) 180 58 28 6,4 35

Nombre de spermatozo¨ıdes apr`es le swim-up (millions) 80 31 16 3,8 20

Perte en spermatozo¨ıdes (%) 55,6 46,6 42,9 40,6 42,9

Tableau 9 – R´esultats obtenus apr`es lyse des cellules somatiques pour 5 ´echantillons.

1.1.3 Gradient de densit´es discontinues

Le gradient de densit´es discontinues est utilis´e afin de s´eparer les diff´erents composants du sperme en couches cellulaires. Les spermatozo¨ıdes plus denses vont

161 lors  de  l’utilisation  du  gradient  80%

préliminaires,  la  vitesse  de  centrifugation  à  900g  est  d’abord  testée.  La  perte  en 

n’est  que 

impossible  d’exclure  toutes  les  cellules  somati

49 44,5 36,5 26,6 0 10 20 30 40 50 60 500 900 1000 P e rt e e n s p e rm a to z o ïd e s ( % ) Vitesse de centrifugation (g)

Gradients de densités discontinues 80%-40% Gradients de densités discontinues 90%-47,5%

Figure 37 – Perte en spermatozo¨ıdes (%) avec diff´erents gradients de densit´es discontinues

se retrouver dans la partie du gradient 80% ou 90%. La perte en spermatozo¨ıdes est repr´esent´ee dans la figure 37. Dans un premier temps, nous purifions les spermatozo¨ıdes en utilisant le gradient 80%-40%. Deux vitesses de centrifugation `a 500g et `a 900g pendant 20 minutes sont test´ees. La centrifugation `a 500g permet de r´ecup´erer 51% des spermatozo¨ıdes par rapport `a la quantit´e initiale. Quand la vitesse est augment´ee `a 900g, 55,5% des spermatozo¨ıdes sont r´ecup´er´es. Etant donn´e que lors de l’utilisation du gradient 80%-40% nous notons une perte en spermatozo¨ıdes importante (plus de 40%), nous testons donc le gradient 90%-47,5%. Grˆace aux r´esultats pr´eliminaires, la vitesse

169

de centrifugation `a 900g est d’abord test´ee. La perte en spermatozo¨ıdes est visiblement abaiss´ee de 44,5% avec le gradient 80%-40% `a 36,5% avec le gradient 90%-47,5%. Ensuite, la vitesse de centrifugation est augment´ee `a 1000g, la perte n’est que de 26,6%. La v´erification de la puret´e des spermatozo¨ıdes par observation au microscope et par RT-PCR a r´ev´el´e une contamination par des cellules somatiques. Il est donc impossible d’exclure toutes les cellules somatiques avec un seul gradient de densit´es discontinues.

1.1.4 Association du gradient de densit´es discontinues et de la lyse des cellules somatiques

Le gradient de densit´es discontinues seul ne permet pas d’exclure toutes les cellules somatiques dans le sperme. Nous envisageons une association entre le gradient de

162

densités  discontinues  seul  ne  permet  pas  d’exclure  toutes  les  cellules 

des résultats similaires avec des temps d’incubation de 

permet  d’éliminer  les  cellules  somatiques  persistantes  après  le  gradient  de  densités  discontinues  en  gardant  l’

remarquée. Cette méthode permet d’éliminer 99,2% des cellules  a purification n’exclut pas complètement les cellules somatiques  34,8 99,2 0 20 40 60 80 100 120

Perte en spermatozoïdes Perte en cellules somatiques

Po u rc e n ta g e d e p e rt e ( % )

Moyenne de la perte des cellules

Figure 38 – Perte en spermatozo¨ıdes et en cellules somatiques (%) apr`es association du gradient de densit´es discontinues et de la lyse des cellules somatiques `a partir du

sperme frais

densit´es discontinues et la lyse des cellules somatiques. Pour cela, du sperme est fractionn´e par le gradient de densit´es discontinues 90%-47,5%, puis les spermatozo¨ıdes sont plac´es dans la solution de lyse des cellules somatiques, dans la glace, pendant 20 minutes. Le temps dans la solution de lyse apr`es le gradient de densit´es discontinues est diminu´e par rapport `a la lyse seule. En effet, nous avons observ´e des r´esultats similaires avec des temps d’incubation de 20 minutes ou de 30 minutes dans la solution de lyse. Or la lyse affecte n´egativement les cellules somatiques mais ´egalement les spermatozo¨ıdes. Ainsi, une incubation de 20 minutes permet d’´eliminer les cellules somatiques persistantes apr`es le gradient de densit´es discontinues en gardant l’int´egrit´e des spermatozo¨ıdes. Les pertes en spermatozo¨ıdes et en cellules somatiques sont

repr´esent´ees dans la figure 38. En moyenne, une perte en spermatozo¨ıdes de 34,8% est remarqu´ee. Cette m´ethode permet d’´eliminer 99,2% des cellules somatiques dans le sperme. La purification n’exclut pas compl`etement les cellules somatiques `a cause de la quantit´e initiale importante de cellules rondes dans 2 ´echantillons. Ces ´echantillons pr´esentent initialement plus de 3 millions des cellules somatiques.