Evaluation de l’efficacit´e de deux kits d’extraction d’ARN

Vu que la quantit´e d’ARN pr´esente dans le spermatozo¨ıde est tr`es faible, une m´ethode d’extraction d’ARN optimale permettant d’extraire tous les ARNm spermatiques est donc indispensable. Dans le cadre de la mise au point des techniques, nous comparons l’efficacit´e de deux kits d’extraction d’ARN en terme de rendement qui est le rapport entre la quantit´e d’ARN extrait en nanogrammes et le nombre de spermatozo¨ıdes en millions. Les ARN spermatiques sont extraits par RNeasy plus Mini

Figure 34 – Sch´ema de l’organisation de l’optimisation du gradient de densit´es discontinues suivi de la lyse sur du sperme congel´e

Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) et Nucleosinr RNA XS (Macherey-Nagel, Hoerd, France) selon le mod`ele pr´esent´e dans la figure 35. Apr`es la purification avec du sperme frais ainsi que du sperme congel´e, un mˆeme ´echantillon est divis´e en 2 fractions ´egales dont les ARN spermatiques sont extraits selon les deux kits d’extraction.

Le kit RNeasy Plus Mini est capable de retenir 100µg d’ARN au maximum sur une colonne. Puis, 600µl de la solution RLT Plus (qui contient de la guanidine isothiocyanate, utilis´ee pour lyser les cellules) compl´et´ee avec 100µl de DTT 0,1M (Dithiothreitol) permettant une inactivation des RNases et une lyse efficace des spermatozo¨ıdes, sont ajout´es en suspension. Le lysat est bien homog´en´eis´e par le vortex et transf´er´e dans la colonne afin d’´eliminer l’ADN g´enomique suivi par une centrifugation `a 10000g `a 4◦C pendant 30 secondes. Le lysat est gard´e en ´eliminant la colonne. Ensuite, 600µl d’´ethanol 70% sont ajout´es au lysat et bien homog´en´eis´es. Cette ´etape permet aux ARN de bien s’attacher sur la membrane silica-gel. Ensuite, 600µl du m´elange sont transf´er´es dans une colonne mont´ee sur un tube de 2ml, la colonne est ferm´ee doucement et centrifug´ee `a 10000g pendant 15 secondes. Le filtrat est ´elimin´e, le reste de 600µl du m´elange est transf´er´e dans cette colonne et la mˆeme

B. M ´ETHODES 155

Figure 35 – Sch´ema de l’organisation de l’optimisation de l’extraction d’ARN spermatique

manipulation est r´ep´et´ee.

La colonne est lav´ee par l’ajout de 700µl de tampon RW1 (RNeasyr Minikit, Qiagen) suivie d’une centrifugation `a 10000g pendant 15 secondes. Puis, le liquide est ´elimin´e en retournant le tube de collection.

Ensuite, 500µl du tampon RPE (RNeasyr Minikit, Qiagen) sont ajout´es directement `a la colonne et l’ensemble est suivi d’une centrifugation de 15 secondes `a 10000g. Une fois le filtrat ´elimin´e, ceci est refait une fois en ajoutant 500µl du tampon RPE.

La colonne est transf´er´ee dans un nouveau tube collecteur et centrifug´ee pendant 2 minutes `a 10000g en laissant la colonne ouverte pour la s´echer. Le tube et le filtrat sont ´elimin´es et la colonne est transf´er´ee sur un microtube de 1,5ml. L’´elution est faite en ajoutant 30µl de H20 du kit directement au centre de la membrane. Apr`es une minute d’attente, la colonne ouverte est centrifug´ee une minute `a 10000g pour r´ecup´erer les

ARN. Afin d’obtenir le maximum d’ARN, le filtrat est repris en r´ep´etant une deuxi`eme fois l’´elution.

Quant au Nucleospin RNA XS kit, il est capable de retenir 110µg d’ARN au maximum sur sa colonne. L’ajout de 100µl du tampon RA1 (qui contient de la guanidine thiocyanate) et 2µl de TCPE (Tris 2-carboxyethyl phosphine) permet de r´eduire l’activit´e des RNases. L’ensemble est bien vortex´e en ajoutant l’ARN “carrier”, permettant de retenir mieux les ARN sur la colonne. Ensuite, le m´elange est transf´er´e dans un NucleoSpinrFilter mont´e sur un tube collecteur de 2ml suivi par une centrifugation `a 11000g pendant 30 secondes. La colonne est jet´ee, 100µl d’´ethanol sont ajout´es dans le lysat et l’ensemble est bien homog´en´eis´e. Le m´elange est transf´er´e dans une colonne NuleoSpinrRNA XS mont´e sur un tube collecteur de 2ml. Apr`es centrifugation `a 11000g pendant 30 secondes, la colonne est plac´ee sur un nouveau tube collecteur. L’ajout de 100µl de MDB (Membrane Desalting Buffer) et une centrifugation `a 11000g pendant 30 secondes permettent un lavage de la colonne. L’ADN g´enomique est ´elimin´e par incubation 15 minutes `a temp´erature ambiante apr`es l’ajout de 25µl de rDNase sur la colonne. Ensuite, le premier lavage est r´ealis´e par l’ajout de 100µl de RA2 sur la colonne, une incubation de 2 minutes suivie par une centrifugation `a 11000g pendant 30 secondes. Le deuxi`eme lavage est fait en ajoutant 400µl de tampon RA3 dans la colonne suivi d’une centrifugation `a 11000g pendant 30 secondes. Le filtrat est ´elimin´e, le tube collecteur est repris permettant le troisi`eme lavage par l’ajout de 200µl de tampon RA3 et une centrifugation `a 11000g pendant 2 minutes.

Le tube et le filtrat sont ´elimin´es et la colonne est transf´er´ee sur un microtube de 1,5ml. L’´elution est faite en ajoutant 20µl de H20 du kit directement au centre de la membrane. Apr`es une minute d’attente, la colonne ouverte est centrifug´ee une minute `a 11000g pour r´ecup´erer les ARN. Afin d’obtenir le maximum d’ARN, le filtrat est repris en r´ep´etant une deuxi`eme fois l’´elution.

Suite `a l’extraction d’ARN, un dosage est r´ealis´e au Nanophotom`etre (Implen, Munich, Allemagne). Ce dosage permet d’obtenir la concentration d’ARN (ng/µl) et ´egalement les ratios d’absorbance optique 260/280 et 230/260. Les derniers permettent de v´erifier l’absence de contamination par de l’ADN, des prot´eines ou des solvants.