Purification des spermatozo¨ıdes `a partir du sperme frais 148

1.1.1 Le swim-up

Le swim-up ou la migration ascendante est une technique de pr´eparation du sperme utilis´ee pour s´electionner les spermatozo¨ıdes les meilleurs avant ins´emination intra-ut´erine. Cette technique est bas´ee sur le fait que les spermatozo¨ıdes normaux sont mobiles et peuvent migrer vers le haut d’un liquide nutritif `a l’exclusion des bact´eries, du plasma s´eminal, des cellules somatiques et d’autres spermatozo¨ıdes anormaux et/ou peu mobiles (Figure 28).

Figure 28 – Principes du swim-up : (A) Ajout de BM1 sur le sperme, (B) Obtention d’un culot de cellules par centrifugation et (C) Incubation `a 37◦

Dans le but de r´ecup´erer exclusivement des spermatozo¨ıdes `a partir du sperme frais, nous r´ealisons cette m´ethode sur 5 ´echantillons de sperme. Apr`es ´elimination du liquide s´eminal par un lavage dans du PBS 1X, le culot cellulaire est m´elang´e `a 1500µl du BM1 (Ellios Biotek, France), une centrifugation de 530 g pendant 10 minutes permet d’obtenir un culot cellulaire. Le tube est incub´e `a l’´etuve `a 37◦C, les spermatozo¨ıdes ont tendance `a monter `a la surface (plus riche en oxyg`ene). Apr`es 30 minutes `a une

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heure, nous pr´elevons “le nuage” form´e par des spermatozo¨ıdes.

1.1.2 Lyse des cellules somatiques

La solution de lyse des cellules somatiques (SCLB-Somatic Cells Lysis Buffer) est une solution hypotonique compos´ee de 0,1% SDS (Sodium dod´ecylsulfate) (Euromedex, France) et 0,5% Triton X-100 (Euromedex, France) (Goodrich et al. 2007). ). Bri`evement, un lavage par du PBS 1X permet d’´eliminer le liquide s´eminal. Les cellules sont mises en suspension avec cette solution puis le tube est mis dans la glace pendant 30 minutes. L’absence de cellules somatiques est v´erifi´ee au microscope. La lyse peut ˆetre r´ep´et´ee jusqu’`a l’absence des cellules somatiques. Les spermatozo¨ıdes sont r´ecup´er´es apr`es une centrifugation `a 400g pendant 10 minutes.

1.1.3 Gradient de densit´es discontinues

Le gradient de densit´es discontinues permet de s´eparer les cellules en diff´erentes couches selon leur taille et leur poids mol´eculaire. Les spermatozo¨ıdes plus denses que les cellules somatiques vont se retrouver dans le culot. Nous testons le gradient 80%-40% et le gradient 90%-47,5% en variant la vitesse de centrifugation. Le gradient 40% ou 47,5% (1ml) est d´epos´e d´elicatement sur le gradient 80% ou 90%. Pour le gradient de densit´es discontinues 80%-40%, les vitesses de centrifugation `a 500g et `a 900g sont respectivement utilis´ees et pour le gradient de densit´es discontinues 90%-47,5%, les vitesses de centrifugation `a 900g et `a 1000g sont test´ees. Le sperme est liqu´efi´e pendant 30 minutes `a temp´erature ambiante, puis d´epos´e doucement `a la surface du gradient 40% ou 47,5%. Une centrifugation permet de s´eparer les cellules en diff´erentes couches (Figure 29). Le liquide s´eminal, le gradient 40% (ou 47,5%) ainsi que l’anneau de cellules somatiques (dans l’interphase du gradient 80%-40% ou 90%-47,5%) sont pr´elev´es compl`etement. Le culot de spermatozo¨ıdes et un peu de gradient 80% (ou 90%) sont r´ecup´er´es. La num´eration est d´etermin´ee au microscope.

1.1.4 Association du gradient de densit´es discontinues et de la lyse des cellules somatiques

La combinaison du gradient de densit´es discontinues et de la lyse est employ´ee car une seule m´ethode ne permet pas d’´eliminer toutes les cellules somatiques. Apr`es le gradient 80%-40% ou 90%-47,5%, les spermatozo¨ıdes r´ecup´er´es sont mis en contact

Figure 29 – Sch´ema des diff´erentes couches cellulaires apr`es un gradient de densit´es discontinues. A : Diff´erents composants du gradient de densit´es discontinues. B :

Diff´erentes couches cellulaires obtenues apr`es la centrifugation.

avec la solution de lyse. L’ensemble est incub´e dans la glace pendant 20 minutes. Le culot de spermatozo¨ıdes est obtenu apr`es une centrifugation `a 500g pendant 10 minutes (Figure 30)

Figure 30 – Sch´ema de la purification en utilisant le gradient de densit´es discontinues et la lyse. A, B : Diff´erentes couches cellulaires obtenues apr`es la centrifugation. C :

Les spermatozo¨ıdes incub´es dans la solution de lyse

1.2. Purification des spermatozo¨ıdes `a partir du sperme congel´e

Nous avons travaill´e ´egalement avec du sperme congel´e. D’une part, du sperme frais n’est pas toujours disponible pour la recherche, d’autre part, notre ´etude en aval se focalisera sur une pathologie sp´ecifique ce qui demande une collection de sperme dans

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le cadre de collaborations nationales et cette forme de conditionnement sera utilis´ee. Les paillettes sont d´econgel´ees doucement `a temp´erature ambiante 30 minutes `a l’abri de la lumi`ere. Un lavage par du PBS 1X est effectu´e afin d’´eliminer la solution de cong´elation. Le culot est repris dans 800µl de PBS 1X permettant un comptage et les techniques en aval.

1.2.1 Lyse des cellules somatiques

La mˆeme solution de lyse des cellules somatiques contenant 0,1% SDS et 0,5% Triton X-100 est utilis´ee dans cette exp´erience. Nous testons diff´erents temps d’incubation dans la glace et diff´erents modes d’agitation. Diff´erents temps d’incubation de 5 `a 30 minutes sont appliqu´es. Deux modes d’agitation sont test´es : le mode manuel et le mode

Figure 31 – Sch´ema de l’organisation de l’optimisation de la lyse sur du sperme congel´e.

sur roue. Dans le cas du mode d’agitation manuel, le tube contenant la solution de lyse et les spermatozo¨ıdes incub´es dans la glace est retourn´e manuellement toutes les 2 `a 3 minutes. En revanche le mode d’agitation sur roue permet une agitation continue dans la chambre froide. Les spermatozo¨ıdes sont ensuite r´ecup´er´es grˆace `a une centrifugation

`a 400g pendant 10 minutes (Figure 31). Nous testons ces diff´erentes conditions de lyse des cellules somatiques sur 5 ´echantillons de sperme congel´es.

1.2.2 Gradient de densit´es discontinues

Selon les r´esultats obtenus lors de l’exp´erience sur du sperme frais, nous utilisons le gradient de densit´es discontinues d’Isolater90%-47,5% (Irvine Scientific, Paris, France) avec une centrifugation fix´ee `a 20 minutes. Par contre, la vitesse de centrifugation varie de 500g `a 1200g (Figure 32). Les diff´erentes couches cellulaires sont obtenues selon la figure 33. Le PBS est retrouv´e en surface, puis l’anneau des cellules somatiques et le gradient 47,5%. Un anneau des spermatozo¨ıdes est situ´e `a l’interphase du gradient 47,5% et 90%. Un culot des spermatozo¨ıdes est ´egalement form´e au fond du tube. Nous pr´elevons le PBS et le premier anneau des cellules somatiques. L’anneau des spermatozo¨ıdes et le culot sont mis en suspension avant le comptage sur la cellule de Malassez. Cinq ´echantillons sont utilis´es afin d’optimiser le gradient de densit´es discontinues.

Figure 32 – Sch´ema de l’organisation de l’optimisation du gradient de densit´es discontinues sur du sperme congel´e

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Figure 33 – A : Diff´erents composants du gradient de densit´es discontinues. B : Diff´erentes couches cellulaires obtenues apr`es la centrifugation.

1.2.3 Association du gradient de densit´es discontinues et de la lyse des cellules somatiques

La meilleure condition du gradient de densit´es discontinues est suivie par la meilleure condition de lyse des cellules somatiques. L’objectif de cette exp´erience est d’´eliminer toutes les cellules somatiques. Pour cela, du sperme est d´epos´e doucement sur le gradient d’Isolate 90%-47,5%. Ensuite la centrifugation qui a donn´e le meilleur r´esultat auparavant permet de r´ecup´erer les spermatozo¨ıdes. Puis, les cellules sont mises en suspension avec la solution de lyse et l’incubation est faite dans la meilleure condition obtenue par l’exp´erience pr´ec´edente (Figure 34). Cette exp´erience est faite sur 12 ´echantillons de sperme congel´e.