Le détecteur UV peut être remplacé par un spectromètre de masse. Après séparation, la phase mobile contenant les composés à analyser est directement introduite dans le spectromètre de masse.
La HPLC-MS/MS apparaît être la technique de choix pour détecter les lésions de l’ADN de façon spécifique. De plus, la sensibilité de cette technique, de l’ordre de quelques lésions/108 nucléosides normaux dans quelques microgrammes d’ADN, est intéressante (Koc
et al., 2002, Singh et al., 2006).
Il existe différents types de spectromètres de masse qui sont essentiellement caractérisés par leur source d’ionisation et leur analyseur. Dans le cas de ce travail, il s’agit d’un spectromètre de masse composé d’une source d’ionisation de type électrospray, et d’un
analyseur triple quadripolaire (Schéma 35). La source d’ionisation permet la transformation des composés séparés lors de l’HPLC en ions positifs ou négatifs selon le mode choisi. De plus, ce type de source permet d'éliminer le solvant avant l'entrée de l'analyseur du spectromètre de masse, ce qui est indispensable car ce dernier travaille sous vide. Pour cela, un spray est formé en sortie d’un capillaire par ajout d’azote, et l’échantillon est nébulisé sous forme de petites gouttelettes. Dans la chambre d’ionisation, grâce au champ électrique élevé (quelques kV) et à l’application d’azote chaud, les gouttelettes sont soumises au phénomène de désorption de champ ; le solvant s’évapore, le champ électrique augmente et les ions migrent en surface des gouttes jusqu’à ce qu’ils soient libérés par éclatement des gouttes. Les ions peuvent ensuite pénétrer dans le premier quadripôle de la partie « analyseur » du spectromètre. Un quadripôle est constitué de quatre cylindres entre lesquels un champ électrique oscillant et un champ électrique fixe se superposent. Selon les conditions de champs électriques appliqués, seuls certains ions, caractérisés par leur rapport masse/charge (m/z), peuvent traverser le quadripôle, selon une trajectoire sinusoïdale, les autres étant défocalisés et perdus dans le quadripôle. Les ions filtrés peuvent entrer dans le quadripôle suivant. En balayant sur une gamme de champs électriques dans le quadripôle, il est possible de tracer le spectre de masse de l'échantillon. Dans le cas d’un analyseur triple quadripolaire comme celui utilisé dans cette étude (Schéma 35), le premier quadripôle permet aussi de sélectionner spécifiquement un ion parent qui est ensuite fragmenté par collision avec un gaz inerte dans le second quadripôle, appelé cellule de collision. Le dernier quadripôle permet d'analyser les ions fils issus de la fragmentation.
Schéma 35 : Représentation schématique d’une source électrospray (en mode positif) associée à un analyseur triple quadripôles.
Enfin, un détecteur d’ions et un système de conversion permettent de transformer les signaux de détection d’ions en des chromatogrammes ou des spectres de masse.
Notons que différents modes de fonctionnement de l’analyseur triple quadripôles peuvent être choisis, selon le type de filtration des ions appliqué à chaque quadripôle. Dans notre cas, le mode le plus couramment utilisé est le mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) permettant de quantifier très spécifiquement les molécules selon des couples de rapport m/z, également appelés transitions, constitués du rapport m/z de l’ion parent et de l’un de ses ions fils. A des fins de caractérisation, des analyses MS1 (spectre de masse simple des composés) et MS2 (spectre de fragmentation) ont également été réalisées.
La quantification de chaque photoproduit est effectuée après calibration de la réponse en spectrométrie de masse lors de l’injection d’un échantillon contenant tous les photoproduits de thymine et cytosine en concentration connue.
V.8.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF
V.8.1. Principe
Dans le cas de l’analyse par MALDI-TOF, l’oligonucléotide est cristallisé dans une matrice et il est désorbé par laser (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation –Time Of Flight). Le détecteur est un analyseur temps de vol. Il s’agit d’un tube, libre de champs, qui achemine les ions jusqu'au détecteur. A l’entrée du tube, une même énergie cinétique (Ec=1/2 mv2) est donnée à tous les ions produits. Ainsi, le temps mis par un ion pour parcourir le tube de vol dépend de son rapport m/z. Si deux ions portent la même charge, l'ion le plus léger arrive au détecteur avant l'ion le plus lourd. L’analyse nécessite 5 à 10 fois moins de produit qu’une analyse par spectrométrie de masse avec ionisation par electrospray. L’analyse MALDI-TOF permet généralement de détecter l’ion pseudo-moléculaire, ainsi que les ions « multichargés », mais en quantité beaucoup moindre que par ionisation electrospray. L’analyse par MALDI-TOF est donc la technique de choix pour l’analyse des grosses molécules (protéines, oligonucléotides), bien qu’elle apporte moins d’informations structurales que la spectrométrie de masse avec ionisation par electrospray.
V.8.2. Mise en œuvre
Les analyses MALDI-TOF ont été effectuées par Christine Saint-Pierre (CEA Grenoble/INAC/SCIB/LAN), afin de vérifier la masse moléculaire des oligonucléotides 11mer synthétisés. Les spectres MALDI ont été enregistrés sur un spectromètre BIFLEX de
est l’acide 3-hydroxypicolinique (35-40 mg/mL dans du citrate d’ammonium à 10 mM). Les échantillons sont dessalés sur de la résine échangeuse de cation DOWEX -50W X 8-200 (Sigma). Ils sont ensuite déposés sur la cible du spectromètre en mélangeant 1 µl de solution de matrice et 1 µl de solution d’échantillon (co-cristallisation). Une analyse MALDI-TOF a également été utilisée de façon à vérifier la position du SP dans la séquence de l’oligonucléotide. Des spectres MALDI-TOF ont ainsi été enregistrés à différents temps au cours de la digestion ménagée de l’oligonucléotide par des exonucléases.