SPLBsC141A avec le substrat SPTpT par spectrométrie de masse MS
III.3.2. Identification du produit majoritaire A
Nous avons procédé de la même façon pour identifier le produit majoritaire A issu de
l’incubation de SPLBsC141A avec le SPTpT (Figure 49), c’est-à-dire par purification du composé puis réalisation du spectre de fragmentation MS2. Ce produit, de temps de rétention HPLC de 21,6 min donne un rapport m/z en spectrométrie de masse electrospray négatif égal à 609. La différence de masse par rapport au dinucléoside monophosphate de thymines (TpT) est de 64 unités de masse, ce qui correspond à l’addition d’une fonction acide sulfinique sur une des thymines. Cette fonction SO2H pourrait provenir du dithionite (S2O42-) utilisé comme
réducteur du centre [4Fe-4S]. La même hypothèse que précédemment, selon laquelle un radical sur une des thymines serait piégé par le dithionite en solution (« SO2– »), peut donc également être envisagée.
Le spectre de fragmentation MS2 réalisé en mode négatif est présenté Figure 53. Malheureusement, la présence des deux dinucléosides monophosphates abasiques
[M-ThySO2-H]- et [M-Thy-H]-, ne permet pas de conclure quant à la position du groupement
SO2 sur le dinucléoside monophosphate.
Figure 53 : Spectre de fragmentation de l’adduit A en mode négatif. Le pic [M-Thy-H]- de m/z = 483 (en orange) correspond à la perte de la thymine en 5’ (dinucléoside monophosphate avec une seule base en 3’), le pic [M-ThySO2-H]
-
de m/z = 419 (en orange) correspond à la perte de la thymine modifiée en 5’ (dinucléoside monophosphate avec une seule base en 3’) le pic [Thy-H]- de m/z = 125 (en bleu) correspond à la thymine déprotonée perdue. Thy : Thymine. dRP : désoxyribose phosphate. dTMP : thymidine monophosphate. M : ion parent.
Cette incertitude a pu être levée grâce à la réalisation du spectre de fragmentation en mode MS2 positif. Les dinucléosides monophosphates non modifiés présentent également une fragmentation typique dans ces conditions d’ionisation. En effet, celle-ci est caractérisée par la perte du nucléotide protoné du côté 3’ (en vert sur le Schéma 44), ainsi que du nucléoside déshydraté du côté 5’ (en rouge sur le Schéma 44). Un exemple est représenté avec les dinucléosides dUpT et TpdU sur le Schéma 44.
Schéma 44 : Fragmentation typique des dinucléosides monophosphates non modifiés en mode positif.
Exemples de dUpT et TpdU.
La fragmentation en mode positif du composé A suit bien cette règle comme le montre
la Figure 54. En effet, côté 3’, le nucléotide protoné (vert) correspond à la thymidine monophosphate modifiée par le groupement SO2H (m/z = 369). Côté 5’, le fragment
correspondant au nucléoside déshydraté est ici la thymidine non modifiée (m/z = 225).
Figure 54 : Spectre de fragmentation de l’adduit A en mode positif. Le pic [dTMPSO2+H]+ de m/z = 369 (en vert) correspond à la thymidine monophosphate en 3’modifiée, le pic [dThd-H2O+H]+ de m/z = 252 (en rouge) correspond thymidine déshydratée en 5’ non modifiée. Thy : Thymine. Thd : Thymidine. dTMP : thymidine monophosphate. M : ion parent.
Si le groupement SO2H était sur la base en 5’, la fragmentation aurait donné les pics de
masse suivant : m/z = 323 pour la thymidine monophosphate intacte et m/z = 289 pour la thymidine déshydratée additionnée du groupe SO2H. La Figure 54 montre que ces pics de
masse n’apparaissent pas sur le spectre, excluant cette possibilité.
Il est possible d’en conclure que le composé A, obtenu de façon majoritaire lors de
l’incubation de la SPLBsC141A avec le substrat SPTpT, est une dithymidine monophosphate modifiée en 3’ par la fonction acide sulfinique.
Ces résultats sont également cohérents avec l’identification du produit minoritaire B, la
dithymidine monophosphate hydroxylée côté 3’, indiquant qu’un radical se forme sur la base en 3’ dans les deux cas.
III.4.
Modélisation chimique de la formation des produits A et B
Pour identifier de façon non ambiguë la position exacte des groupements SO2H et OH
présents sur les thymines des adduits A et B, des précurseurs chimiques de ce radical centré
sur le méthyle ont été utilisés. Il s'agit des 5-(thiophénylméthyl)-2'-désoxyuridylyl-(3'5')- thymidine (TSΦpT) et thymidylyl-(3'5')-5-(thiophénylméthyl)-2'-désoxyuridine (TpTSΦ). Ce sont des dérivés du TpT (Thymidily(3'5')thymidine) portant une fonction thiophényle sur le méthyle d'une des thymines, soit en 3’ soit en 5’ (Schéma 45). Pour plus de clarté, ces composés seront appelés TSΦpT lorsque le thiophényle est positionné sur la thymine côté 5', et TpTSΦ lorsque le thiophényle est positionné sur la thymine côté 3'. Ces composés sont connus pour générer de façon photochimique le radical α–thyminyle par rupture homolytique de la liaison carbone – soufre comme le montre le Schéma 45.
Schéma 45 : Dérivés thiophénylés précurseurs de radical. TSΦpT : 5-(thiophénylméthyl)-2'-désoxyuridylyl- (3'5')-thymidine. TpTSΦ : thymidylyl-(3'5')-5-(thiophénylméthyl)-2'-désoxyuridine. En bas, schéma de la
rupture homolytique de la liaison C – S par irradiation UV.
Ces composés ont été mis en présence ou non de dithionite ou d’oxygène puis exposés au rayonnement UV-C. Les différents mélanges réactionnels sont décrits dans le Tableau 17.
cuve TpTSΦ (~40 µM) TSΦpT (~40 µM) +/- O2 +/- dithionite (2 mM) 1
+
–
+
– 2+
–
– – 3+
–
–+
4–
+
–+
5–
+
+
–Tableau 17 : Composition des mélanges réactionnels à irradier. + signifie en présence d’O2 ou de dithionite, – signifie en absence d’O2 ou de dithionite.
Après exposition de ces solutions aux UV (254 nm) pendant 5 minutes, celles-ci sont analysées par HPLC couplée à la spectrométrie de masse d'abord en mode MRM pour suivre les différents produits de réaction (TpT de m/z = 545, adduit SO2H de m/z = 609 et adduit OH
de m/z = 561) puis en mode MS2 afin d'obtenir les spectres de fragmentation des différents adduits. Les spectres des différents produits sont alors comparés avec ceux des composés A et B obtenus précédemment (Figure 52 et Figure 53).
Premièrement, l'irradiation conduit bien à la disparition des dérivés thiophénylés et à l'apparition de nouveaux produits. En absence de dithionite (cuves 1, 2 et 5), les produits
majoritairement formés sont les deux produits hydroxylés respectivement TpTOH après irradiation de TpTSΦ et TOHpT, issu de la décomposition de TSΦpT, dont le rapport m/z est égal à 561 en mode négatif. Ces deux composés ont des temps de rétention différents : 24,8 minutes et 25,5 minutes (Figure 55 – II), et également des spectres de fragmentation en mode négatif différents. En présence de dithionite et en conditions d'anaérobiose (cuves 3 et 4), l'irradiation conduit à la formation de deux adduits SO2H (m/z = 609) distincts selon que le
thiophényle était initialement côté 5’ ou 3’. C'est donc bien le dithionite présent en solution qui induit la formation de l'adduit par recombinaison radicalaire entre le radical centré sur le méthyle de la thymine et SO2-. Ces deux adduits SO2H ont des temps de rétention HPLC
différents comme le montre la Figure 55 – I : TpTSO2H (Rt = 21,6 min, issu de TpTSΦ) et
TSO2HpT (Rt = 22,2 min, issu de TSΦpT). La comparaison de ces temps de rétention avec
ceux des produits issus de la réaction enzymatique (Figure 55 – III) permet de conclure sans ambiguïté que le produit majoritaire A est TpTSO2H (21,8 min) alors que le produit
minoritaire B est TpTOH (25,5 min). Dans les deux cas, les fonctions additionnées sur le
radical intermédiaire sont bien sur le méthyle de la base en position 3’.
Figure 55 : Chromatogrammes HPLC-MS/MS. Adduits SO2H issus de l’irradiation en anaérobiose en présence de dithionite (I), adduits OH issus de l’irradiation en absence de dithionite (II). Comparaison avec les produits A et B obtenus lors de l’incubation de SPTpT avec SPLBsC141A (III).
Le Schéma 46 récapitule les différents produits observés lors de l’irradiation de ces modèles.
Schéma 46 : Récapitulatif des adduits obtenus après irradiation de TSΦΦΦΦpt et TpTSΦΦΦΦ. dR :
désoxyribose, P pont phosphodiester.
En plus des analyses HPLC montrant des temps de rétention identiques entre A et
TpTSO2H, ainsi qu’entre B et TpTOH, ce sont aussi les spectres MS2 en mode négatif de
l'adduit A (Figure 53) et de TpTSO2H (Figure 56 – I) qui sont identiques. En effet, les deux
spectres possèdent les mêmes ions fils avec les mêmes intensités, signifiant que les deux produits sont identiques. Ces spectres sont radicalement différents de ceux de TSO2HpT
Figure 56 : Spectres de fragmentation en mode négatif des adduits SO2H obtenus après irradiation de
TpTSΦΦΦΦ et TSΦΦΦΦpT. I. Spectre MS2 de TpTSO2H. II. Spectre MS2 de TSO2HpT.
L’ensemble de ces données montre qu’en absence de la cystéine C141, la réaction de réparation est bloquée à un intermédiaire radicalaire, qui est majoritairement piégé in vitro par le dithionite en solution. Une deuxième information apportée par ces expériences concerne la position de ce radical. Les données HPLC-MS/MS démontrent clairement que ce radical est positionné sur le méthyle de la thymine en 3’.