Caractérisation du Photoproduit des spores SPTpT (thymidylyl-(3’-5’) thymidine) et comparaison au SP naturel

Une solution pure de SPTpT est obtenue (5 mL), comme le montrent le chromatogramme HPLC enregistré à 260 nm et le spectre de masse du produit (Figure 33). Il faut noter qu’un seul diastéréoisomère est obtenu lors de la synthèse du SPTpT par irradiation de TpT en présence de DPA. En effet, un seul pic HPLC est observé et le spectre RMN 1H dans D2O détaillé plus loin prouve qu’il n’y a qu’un isomère présent en solution.

Figure 33 : Caractérisation du SPTpT obtenu après irradiation de TpT en présence de DPA et purification. A. Chromatogramme HPLC enregistré à 260 nm (Rt = 19,1 min). B. Spectre de masse MS1 du

SPTpT, l’ion pseudo-moléculaire [M-H]- a un rapport m/z de 545,4 amu (masse moléculaire calculée : 546,4 g.mol-1).

Le SPTpT pur a été quantifié par spectrophotométrie UV-visible. L’absorbance au maximum d’absorption (267 nm) d’1 mL d’une solution diluée au 1/100e est de 0,049 unités

d’absorbance.

Différentes dilutions de cette solution ont été utilisées afin de déterminer le coefficient d’absorption molaire (ε) de cette molécule. Pour cela, chaque dilution a été injectée en HPLC- MS/MS et quantifiée grâce à une solution de SPTpT isolé à partir de l’ADN (préparée précédemment par Thierry Douki) de concentration connue. Ainsi un graphe représentant l’absorbance à 267 nm des solutions en fonction de leur concentration a-t-il été tracé (Figure 34). Grâce à la loi de Beer-Lambert, le coefficient directeur de la droite passant par les points expérimentaux nous donne la valeur d’ε qui vaut 11 258 M-1.cm-1.

Figure 34 : Détermination du coefficient d’absorption molaire

εεεε du SPTpT. La droite de régression linéaire a pour équation y =

11258 x, R2 = 0,999.

Grâce à ce calcul, il est maintenant possible de quantifier le SPTpT en solution par spectrophotométrie UV-visible. La solution pure de SPTpT (5 mL) a une concentration de

435 µM. On a donc obtenu 1,2 mg de SPTpT, soit un rendement de synthèse de 1,4 %.

Le SPTpT synthétisé dans ces conditions possède le même temps de rétention que le SPTpT obtenu à partir d’hydrolyse enzymatique de l’ADN de spores irradiées, noté SPTpTspore par la suite (Douki et al., 2005a) lorsqu’il est analysé avec la même colonne et le

même gradient. Afin de comparer plus précisément le SPTpT synthétisé dans cette étude au SPTpTspore, un spectre de fragmentation MS2 a été réalisé en mode négatif pour les deux

molécules (Figure 35). Les deux spectres sont absolument identiques, à la fois en termes de rapport m/z des ions fils ainsi qu’en termes d’intensité relative des fragments. Le SPTpT obtenu par irradiation de TpT est donc absolument identique au SP issu de l’ADN de spores irradiées aux UV-C. Il constitue alors un bon candidat pour l’étude de la stéréochimie du Photoproduit des spores, ainsi que pour des études enzymatiques. De plus, ce résultat montre qu’un seul diastéréoisomère du Photoproduit des spores est produit dans l’ADN des spores. Ce produit a été utilisé comme substrat de l’enzyme SPL purifiée et reconstituée, et l’activité de l’enzyme avec ce substrat est détaillée dans la partie III.

Figure 35 : Comparaison des spectres de masse MS2 du SPTpT obtenu après irradiation de TpT en présence de DPA et du SPTpTspore isolé de l’ADN de spores irradiées. A. Spectre MS2 du SPTpT. B. Spectre

MS2 du SPTpTspore issu de l’ADN des spores (Reproduction de la figure de T. Douki et coll. (Douki et al., 2003a)). L’ion précurseur est à m/z = 545 dans les deux spectres.

I.3.

Détermination de la configuration absolue du C5 du SPTpT

par RMN

Comme indiqué dans l’introduction, la stéréochimie exacte du Photoproduit des spores est encore inconnue, même si quelques études ont déjà été réalisées sur ce sujet. En effet, grâce à une synthèse totale, T.P. Begley et coll. (Kim et al., 1995) ont pu obtenir deux diastéréoisomères du SP sous la forme d’un dinucléoside monophosphate (SPTpT) pour lesquels le méthyle non modifié est sur le carbone en 5’ (voir Introduction page 62 – Figure 13). Une caractérisation RMN des deux diastéréoisomères R et S a été effectuée sans identification précise de la configuration absolue du carbone asymétrique des deux isomères. Cependant, le manque de comparaison de ces produits de synthèse avec le SP naturel ne permet pas de conclure quant à la stéréoconfiguration du Photoproduit des spores naturel. De plus, ces produits n’ont jamais été testés en termes de réparation avec la Spore Photoproduct

Lyase. Plus récemment, T. Carell et coll. (Friedel et al., 2006a, Friedel et al., 2006b) ont déterminé, également par RMN, la configuration de deux analogues du SP, le dinucléoside sans le pont phosphodiester (SPTT sur le Schéma 39), ainsi qu’un dinucléoside dans lequel les sucres sont reliés par une chaîne alkyle (SPT=T sur le Schéma 39). Ils montrent que seul le dinucléoside SPTT de configuration S est réparé par l’enzyme SPL (SPL de B. subtilis et SPL de Geobacillus stearothermophilus reconstituées) suggérant que le Photoproduit des spores naturel soit de configuration S.

Schéma 39 : Analogues du Photoproduit des spores synthétisés et caractérisés par RMN. Le dinucléoside

sans le pont phosphate est noté SPTT, le dinucléoside dont les sucres sont reliés par une chaîne alkyle est noté SPT=T. Kim et coll., Friedel et coll. ont tous synthétisé et caractérisé à chaque fois les deux isomères R et S.

Le SPTpT synthétisé au cours de ma thèse, identique au SP trouvé dans les spores, a été obtenu en quantité suffisante pour nous permettre de débuter une étude structurale complète. Nous avons choisi une étude par RMN. Cette étude comporte deux objectifs : 1) déterminer le côté du dinucléoside monophosphate où le carbone asymétrique est présent (base côté 5’ ou base côté 3’), c’est ce que nous appelons par la suite le sens de fixation, et 2) la configuration absolue du C5 asymétrique (R ou S) de cette base. En parallèle, des études

théoriques ont été accomplies par Claire Mantel et Jean-Marie Mouesca (Laboratoire de Résonances Magnétiques du CEA Grenoble) afin de conforter les résultats obtenus par l’étude RMN.

Deux séries d’expériences RMN ont été effectuées à 500 MHz. Une première série a été réalisée sur le SPTpT en solution dans D2O et une deuxième série sur le SPTpT en solution

dans le DMSO deutéré. Les différentes expériences RMN réalisées sont récapitulées dans le Tableau 12 et la notation utilisée pour nommer les atomes d’hydrogène et de carbone du SPTpT est présentée Schéma 40.

1 H 13C 1 H-13C HSQC 1 H-13C HMBC 31 P 1 H-31P

HSQC COSY TOCSY NOESY ROESY

D2O

 















DMSO

_{ }

_

_

_

_



Tableau 12 : Récapitulatif des expériences RMN réalisées dans D2O ou DMSO.

Schéma 40 : Numérotation des hydrogènes et carbones du SPTpT. La

position du méthyle inchangé sur le côté 5’ (base A) n’a été complètement établie qu’en cours d’analyse RMN. La numérotation est utilisée indifféremment pour le carbone et le(s) atome(s) d’hydrogène correspondant(s). A titre d’exemple, 1’ est utilisé pour l’hydrogène H1’ porté par le carbone C1’.